TLR3调节HCMV相关恶性胶质瘤PD-L1表达的机制研究

发布时间：2020-11-15 19:25

　　 恶性胶质瘤是成人脑部肿瘤中最常见的类型,约占颅脑肿瘤的40-50%,因为其浸润性而难以通过传统的手术切除,并以其极低的生存率为特征。而人类巨细胞病毒(HCMV)目前在胶质瘤中所发挥的作用引起了相当大的兴趣和争议。程序性死亡因子1(PD-1)的单克隆抗体在胶质瘤的治疗过程中取得了一定的进展,但治疗结果仍不尽如人意,其程序性死亡因子配体1(PD-L1,CD274),被认为和恶性胶质瘤的免疫逃逸机制有关,并与HCMV的感染具有相关性,而Toll样受体3(TLR3)在病原体感染的细胞或动物中可以诱导抗病毒的状态,通过对TLR3和胶质瘤中PD-L1表达变化关系的研究,我们希望探究新的联合免疫治疗方法,为临床治疗提供新的思路。目的:研究在HCMV感染的胶质瘤中,PD-L1的表达机制是否与TLR3相关。方法:使用免疫组织化学染色技术检测临床胶质瘤标本中IE2、PD-L1和TLR3的表达情况;HCMV感染胶质瘤细胞后,使用q-PCR技术和免疫荧光染色技术检测PD-L1 RNA和蛋白的表达情况;细胞转染技术封闭TLR3的表达;使用WB技术检测封闭TLR3表达的胶质瘤在感染HCMV后PD-L1的表达情况;使用ELISA技术检测封闭TLR3表达的胶质瘤感染HCMV后细胞因子TGF-β和IL-8的分泌情况。结果:我们在70%的Ⅲ级和85%的Ⅳ恶性胶质瘤标本中发现IE2阳性,与IE2阴性的标本相比较,PD-L1和TLR3的表达量均呈现增高,P0.05;在HCMV感染胶质瘤后0、6和72h提取RNA,0、24和72h提取蛋白质,检测PD-L1的RNA和蛋白表达量升高20倍以上;转染siRNA后,TLR3的表达量通过WB检测下降70%以上,认为封闭成功;封闭TLR3后,感染HCMV后,PD-L1的表达量相较于未封闭组下降明显,具有统计学意义,P0.05;封闭TLR3后,会诱导T细胞TGF-β的分泌,上升2倍以上,但抑制IL-8的分泌,几乎无法检测。结论:HCMV感染的胶质瘤细胞中PD-L1的表达量相较于未感染组更高,这可能是HCMV促进胶质瘤恶性程度升高的原因之一。而在封闭TLR3的表达后,在HCMV感染的肿瘤细胞中可以观察到PD-L1的表达下降,我们认为PD-L1的表达可以由胶质瘤细胞中的TLR3触发介导,因此,我们提出了使用组合PD-L1单克隆抗体与阻断TLR3触发来针对HCMV感染的胶质母细胞瘤的新型免疫治疗。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.4
【文章目录】：
摘要
abstract
引言
实验材料和试剂
    1.病理样本和细胞病毒
    2.主要实验仪器和设备
    3.主要实验试剂来源及配制方法
        3.1 主要实验试剂来源
        3.2 主要实验试剂配制方法
实验方法
    1.临床标本组织化学染色
    2.胶质瘤细胞感染HCMV
        2.1 细胞复苏
        2.2 细胞的传代
        2.3 细胞的冻存
        2.4 HCMV AD169 毒株的制备
        2.5 HCMV病毒的滴度的测定
        2.6 HCMV感染U87、原代胶质瘤和星形胶质细胞后RNA提取
        2.7 RNA反转录为DNA
        2.8 荧光实时定量PCR分析HCMV感染神经胶质瘤细胞后PD-L1 的表达
    3.免疫荧光技术检测细胞感染HCMV后 PD-L1 的表达变化
        3.1 细胞感染HCMV处理
    4.siRNA转染细胞封闭TLR3 表达
        4.1 小干扰RNA的构建
        4.2 细胞转染siRNA
    5.HCMV感染TLR3 封闭的胶质瘤细胞后PD-L1 的表达情况
    6.共培养检测细胞因子
    7.统计学分析
结果分析
    1.临床标本组化染色分析
    2.细胞感染HCMV后 PD-L1的mRNA和蛋白表达变化
    3.封闭TLR3 表达及封闭后HCMV感染细胞PD-L1 的表达变化
    4.封闭TLR3 后诱导TGF-β分泌并抑制IL-8 分泌
讨论
参考文献
综述
    1.1 人巨细胞病毒
    1.2 胶质瘤与HCMV的关系
    1.3 PDL1 参与免疫逃逸
    1.4 HCMV感染后Toll样受体的变化
    1.5 TLR3 触发PD-L1 上调
    1.6 结论
    综述参考文献
攻读学位期间研究成果
致谢

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本文编号：2885113