蛋白激酶Pim1介导糖尿病周围神经病变的作用及其机制

发布时间：2020-11-16 11:45

　　 糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常见的并发症,其发病机制尚不明确,目前尚没有有效的治疗措施。因此,探讨DPN的精确的发病机制为缓解患者病痛,具有重要意义。目前认为,造成DPN的主要原因是高血糖直接作用于脊神经节感觉神经元并造成神经元的退变。高糖毒性刺激能激动多种信号通路,如PERK通路及其介导的细胞凋亡、氧化应激及内质网应激,并进一步激发一系列细胞因子与趋化因子的产生。细胞因子和趋化因子会加重细胞氧化应激与氮化应激,并促进神经元细胞凋亡。本课题所研究的蛋白激酶Piml属于丝/苏氨酸激酶,其在细胞内处于持续激活状态,它不需要上游激酶的磷酸化,因此Piml激酶的活性直接与其表达水平相关,并且受转录与翻译水平的调节。虽然蛋白激酶Piml在其他领域已有研究报道,但是本研究探讨Piml在DPN引起的氧化应激、内质网应激及其诱导的凋亡和糖尿病神经病理性疼痛中的新作用,并且探讨Piml与PERK-ATF4-CHOP信号通路的新的相互关系。本课题利用链脲霉素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病小鼠模型来检测Piml表达变化,发现糖尿病神经病理性疼痛小鼠背根神经节(DRG)神经元Piml激酶的表达明显升高。为了验证Piml是否是DRG神经元存活的重要分子,本研究利用体外培养的DRG神经元,使用免疫荧光检测Piml在DRG神经元中的表达与定位,结果显示,Pim1不仅在DRG神经元中有表达,而且与DRG神经元亚型降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)阳性和神经丝蛋白-200(neurofilament200,NF 200)阳性神经元共定位。随后发现,Pim1蛋白水平表达自高糖处理12h起升高显著,故假设Pim1的上调是神经元对高糖损伤的保护反应。基于以上研究,本研究利用Pim1抑制剂TCS抑制其活性后研究Pim1对DRG神经元细胞存活的作用:经CCK8检测神经元细胞的存活率降低、TUNEL染色表明其细胞凋亡显著增强;Western blot技术检测显示pBad以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达水平显著下调。这些研究结果表明,抑制蛋白激酶Pim1活性,DRG神经元经高糖刺激后更容易受到伤害。为了进一步验证Pim1是否为DRG神经元细胞存活的保护因素,Pim1能否抑制高糖引起的氧化应激、内质网应激及细胞凋亡,本研究利用DRG神经元Pim1抑制剂TCS抑制Pim1激酶活性来探究高糖毒性对神经元氧化应激的作用。结果显示,高糖毒性作用使神经元细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平明显升高。信号通路分子PERK、CHOP以及ATF4的蛋白表达在高糖处理后虽有上调趋势,但给予TCS后,均显著上调,这表明抑制了 Pim1的活性可能通过该通路加重了内质网应激。通过以上结果发现,虽然高糖条件下,DRG神经元内ROS水平以及细胞凋亡并没有显著增加,可能是与Pim1激酶水平上调有关,但是在使用TCS抑制Pim1活性后,细胞凋亡及ROS显著增加,表明抑制Pim1激酶的活性后敏化了 DRG神经元对高糖损伤的反应。这些研究结果为以Pim1激酶为靶点的治疗策略的制定提供了新的实验依据。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R747.9
【部分图文】：

２?ＤＰＮ小鼠ＤＲＧ组织Ｐｉｍｌ蛋白水平变化??腹膜腔注射ＳＴＺ?８?ｗ后，取小鼠Ｌ４－５?ＤＲＧ，检测Ｐｉｍｌ蛋白的表达水平变??化。糖尿病组小鼠ＤＲＧ组织Ｐｉｍｌ蛋白表达水平为对照组的１．９０±０．１８倍（图２）。??这表明小鼠体内高血糖持续刺激一定的时间，Ｐｉｍｌ蛋白的表达水平上调与ＤＰＮ??的发生具有一定的关系，但这究竟是一种反应性保护性改变，还是有害的刺激性??改变尚有待于进一步探讨。??２２??

图３蛋白激酶Ｐｉｍｌ在ＤＲＧ神经元及其不同亚群的表达。Ｐｉｍｌ与ＣＧＲＰ（＋）和ＮＦ２００（＋）??神经元亚型共定位。??４高糖刺激下体外培养的ＤＲＧ神经元Ｐｉｍｌ的表达水平变化??培养的ＤＲＧ神经元在高糖刺激之前（０?ｈ）以及经高糖处理６?ｈ、１２?ｈ、２４?ｈ、??４８?ｈ、７２?ｈ、９６?ｈ和１２０?ｈ多个时间点之后，用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ实验检测Ｐｉｍｌ激酶??在ＤＲＧ神经元的表达变化。结果显示，高糖刺激１２?ｈ，Ｐｉｍｌ蛋白表达就出现显??著上调，而且一直持续到１２０?ｈ，其中４８?ｈ？７２?ｈ维持在最高水平（图４）。???ＨＧ???＾?＾?＾?＾??Ｐｉｍｌ?ｍａｍ?ｍｔｍ??－

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本文编号：2886178