氧糖剥夺后CD99介导中性粒细胞穿过脑血管内皮参与缺血性脑损伤炎性机制的研究

发布时间：2020-11-17 11:17

　　 目的:探究脑缺糖缺氧后CD99能否介导中性粒细胞穿越脑血管内皮进而参与脑损伤炎性机制过程。方法:采用细胞实验方法,将鼠脑血管内皮细胞(bEnd.3细胞系)在混合有基础培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)+ 10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%双抗(Pen Strep,PS)的培养液中培养,并在细胞培养箱孵育。采用密度梯度离心法从小鼠骨髓提取中性粒细胞:麻醉处死小鼠,无菌剥离下肢皮肤、肌肉,并提取下肢骨骨髓,使用低渗氯化钠溶液(0.2%NaCl)裂解红细胞,然后用高渗氯化钠溶液(1.6%NaCl)平衡渗透压。随后将提取的白细胞用 PBS 悬浮,并用 Histopaque-1119(密度,1.119g/ml),Histopaque-1077(密度,1.077 g/ml)进行密度梯度离心,两种离心液之间即为中性粒细胞。对提取的中性粒细胞使用瑞氏-吉姆萨染色进行染色确认。CD99在内皮细胞以及中性粒细胞上的表达使用免疫荧光染色的方法检测(内皮细胞在爬片上培养2天,中性粒细胞均匀铺在载玻片上,自然风干),依次孵育一抗二抗并用显微镜观察。用 Western Blot 方法检测对照组、氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)组、白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1β)组、OGD+IL-1β组CD99、细胞间粘附分子-1(Intercellular-adhesion molecule,ICAM-1)、血小板-内皮细胞粘附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion mol ecule,PEC AM-1,CD31)蛋白表达量。将bEnd.3细胞系种在6孔板内进行培养,每组3孔,OGD时间3.5小时,IL-1β浓度10ng/ml,持续16小时,OGD+IL-1β组为IL-1β处理16h后进行OGD处理,处理结束提取蛋白进行Western Blot检测。Western Blot操作不同时间重复3次。低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与 CD99 的关系研究,同样采用WesternBlot检测,将6孔板内培养的细胞分为常氧组与OGD组,每组按0μM,25μM,50μM 3种不同浓度给予HIF-1α抑制剂PX478,各浓度各有3孔。然后分别置于常氧或OGD条件下。最后提取蛋白进行western blot检测。在中性粒细胞迁移实验中,将内皮细胞在24孔板中培养,待细胞80%聚集后,给予对照、OGD、OGD+抗-CD99、抗-CD99处理,CD99抗体浓度25μg/ml,孵育时间30分钟。处理结束后加入中性粒细胞。显微镜下连续拍摄,计数穿过鼠脑血管内皮的中性粒细胞,每组至少重复3次,使用Image J1.46r软件计数穿过内皮细胞的中性粒细胞,并与粘附的细胞数相比进行标准化处理。使用GraphPadPrism 5进行统计分析。数值用均值土标准差表示,采用单因素方差分析比较,组间比较用Newman-Keuls事后检验。组间差异用p值表示*p0.05,**p0.01。结果:bEnd.3内皮细胞及中性粒细胞均可表达CD99,并且在bEnd.3内皮细胞表面表达均匀,不仅是表达在细胞连接位置;OGD后内皮细胞CD99、ICAM-1、PECAM-1表达均升高(对照组对OGD组p0.05),IL-1β处理后ICAM-1升高(对照组对 IL-1β组 p0.01),CD99 表达下降(OGD 组对 OGD+IL-1 β 组 p0.01),PECAM-1无改变。OGD后干扰HIF-1α的表达不影响CD99的表达;OGD组与对照组、OGD+抗-CD99组相比,穿过血管内皮的中性粒细胞数明显增多(对照组对 OGD 组 p0.01,OGD 组对 OGD+抗CD99 组 p0.01)。结论:氧糖剥夺后,脑血管内皮细胞CD99表达升高,并且这种升高不依赖于HIF-1α,CD99具有介导外周中性粒细胞穿越脑血管内皮细胞进而参与缺血性脑损伤的炎性过程的作用。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R743.3
【文章目录】：
缩略词表
摘要
Abstract
第一章 绪论
    参考文献
第二章 氧糖剥夺后CD99介导中性粒细胞穿过脑血管内皮参与缺血性脑损伤炎性机制的研究
    引言
    材料与方法
        内皮细胞培养及中性粒细胞提取
        瑞氏-吉姆萨染色
        免疫荧光
        Western Blot
        中性粒细胞迁移比较
        统计分析
    结果
        内皮细胞及中性粒细胞CD99表达
        IL-1β和OGD对CD99表达的影响
        OGD之后HIF-1α不介导CD99表达升高
        CD99介导OGD后中性粒细胞穿过鼠脑血管内皮细胞
    讨论
    结论
    参考文献
第三章 缺血性脑卒中炎性机制（综述）
    引言
    血流中断
    细胞损伤后免疫炎症反应
        危险相关模式分子（Danger associated molecular pattern molecules,DAMPs）
        免疫细胞激活与炎症因子释放
        细胞因子与缺血损伤
        中性粒细胞浸润与缺血性脑损伤
    总结
    参考文献
致谢
附录一 大动脉粥样硬化性和小动脉闭塞性小卒中患者的早期神经功能恶化的比较
    引言
    对象和方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
附录二 硕士期间科研成果
    期刊文章
    参与课题
    硕士期间所获奖励

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本文编号：2887442