胶质瘤TJ905干细胞Livin-ShRNA裸鼠皮下种植瘤模型的建立及其对Caspase-3,7的影响

发布时间：2017-04-06 20:23

  本文关键词：胶质瘤TJ905干细胞Livin-ShRNA裸鼠皮下种植瘤模型的建立及其对Caspase-3,7的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨胶质瘤TJ905细胞及其干细胞稳转基因Livin短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)皮下种植瘤模型的建立及其对Caspase3,7 m RNA表达的影响。内容:从胶质瘤TJ905细胞中分离胶质瘤干细胞并进行鉴定,分别用Livin-sh RNA和Negative-sh RNA(阴性sh RNA)慢病毒重组质粒转染胶质瘤TJ905细胞及其干细胞,建立相应的裸鼠皮下种植瘤模型,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、RT-PCR等技术检测Livin-sh RNA对胶质瘤TJ905细胞及其干细胞皮下种植瘤模型建立及Caspase3,7 m RNA表达的影响。方法:使用无血清培养法联合免疫磁珠法分选胶质瘤TJ905干细胞,并将分选后的细胞通过血清诱导分化、免疫荧光染色(Nestin、GFAP、β-tubulin)进行鉴定,分别将Livin-sh RNA和Negative-sh RNA慢病毒重组质粒转入胶质瘤TJ905细胞及其干细胞内,RT-PCR检测转染效率,建立稳转细胞株;根据细胞是否转染及其所转染质粒类型,将实验分为A组(转染Livin-sh RNA的胶质瘤TJ905细胞组)、B组(转染Negative-sh RNA的胶质瘤TJ905细胞组)、C组(未转染的胶质瘤TJ905细胞组)、D组(转染Livin-sh RNA的胶质瘤TJ905干细胞组)、E组(转染Negative-sh RNA的胶质瘤TJ905干细胞组)、F组(未转染的胶质瘤TJ905干细胞组);CCK-8检测各组细胞增殖变化规律;FCM检测各组细胞周期变化情况;RT-PCR技术检测各组Caspase-3、Caspase-7 m RNA表达情况;建立相应的裸鼠皮下种植瘤模型,观察其成瘤特性,并检测相应肿瘤模型内Caspase-3、Caspase-7 m RNA表达情况。结果:1、胶质瘤TJ905细胞中含有少量的胶质瘤干细胞,其比例约为0.64%-0.91%;2、A组、B组、D组、E组Livin m RNA的相对表达量(相对于C组及F组)分别为0.117±0.017、0.996±0.025、0.193±0.014、1.003±0.033,A组、B组及D组、E组之间差异具有统计学意义(P0.05);说明Livin-sh RNA可以明显抑制胶质瘤TJ905细胞及其干细胞Livin m RNA的表达;3、CCK-8结果显示,转染48h后A组、B组、C组的吸光度分别为0.828±0.031、1.377±0.026、1.437±0.027,转染72h后A组、B组、C组的吸光度分别为0.896±0.029、1.533±0.035、1.602±0.031,A组与B、C两组之间差异有统计学意义(P0.05),说明Livin-sh RNA可抑制胶质瘤TJ905细胞的增殖;4、FCM结果显示,A组、B组、C组G0/G1期细胞百分比分别为68.68±2.01、63.14±1.39、62.97±1.79,A组与B、C两组之间的差异有统计学意义(P0.05);D组、E组、F组S期细胞百分比分别为35.42±2.18、30.33±1.75、30.57±1.49,D组与E、F两组之间的差异具有统计学意义(P0.05);说明Livin-sh RNA可阻滞胶质瘤TJ905细胞于G0/G1期,阻滞胶质瘤TJ905干细胞于S期;5、F组的成瘤率为100%,C组的成瘤率为37.5%,两组之间差异有统计学意义(P0.05),说明胶质瘤TJ905干细胞比胶质瘤TJ905细胞有更强的致瘤性;A组与B组的成瘤率无明显差异,但其肿瘤体积明显降低,D组与E组的成瘤率及肿瘤体积均无明显差异,说明Livin-sh RNA对胶质瘤TJ905细胞及其干细胞的致瘤性无明显影响,但可使胶质瘤TJ905细胞的增殖速度减慢;6、A组、B组、D组、E组Caspase-3 m RNA的相对表达量(相对于C组及F组)分别为5.163±0.364、1.009±0.038、4.076±0.043、1.116±0.031,A组、B组及D组、E组之间差异有统计学意义(P0.05);A组、B组、D组、E组Caspase-7m RNA的相对表达量(相对于C组及F组)分别为3.067±0.157、1.039±0.022、2.993±0.109、1.045±0.046,A组、B组及D组、E组之间差异有统计学意义(P0.05);说明Livin-sh RNA可诱导胶质瘤TJ905细胞及其干细胞内Caspase-3、Caspase-7 m RNA的表达。结论:胶质瘤TJ905细胞中含有少量胶质瘤干细胞;Livin-sh RNA能有效抑制胶质瘤TJ905细胞的增殖,促进凋亡相关基因的表达,但对其致瘤性无明显影响;胶质瘤TJ905干细胞有更强的致瘤性和更强的恶性变;胶质瘤TJ905干细胞可能具有与胶质瘤TJ905细胞不同的凋亡途径,因此积极寻找Livin基因相关协同基因作为胶质瘤治疗的靶点才可能治愈胶质瘤。
【关键词】：胶质瘤 胶质瘤干细胞 Livin 短发夹RNA 基因治疗
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-17
• 研究现状、成果11-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、胶质瘤TJ905干细胞的分选与鉴定17-30
• 1.1 对象和方法17-20
• 1.1.1 实验试剂17
• 1.1.2 实验仪器17-18
• 1.1.3 细胞培养18
• 1.1.4 胶质瘤TJ905干细胞分选18-19
• 1.1.5 胶质瘤TJ905干细胞的免疫荧光染色19-20
• 1.2 结果20-24
• 1.2.1 CD133阳性细胞的分选20
• 1.2.2 胶质瘤TJ905干细胞的鉴定20-24
• 1.3 讨论24-29
• 1.3.1 胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞24-27
• 1.3.2 胶质瘤干细胞的鉴定27-29
• 1.4 小结29-30
• 二、Livin-shRNA转染与细胞增殖活性检测30-49
• 2.1 对象和方法30-35
• 2.1.1 实验试剂30
• 2.1.2 实验仪器30-31
• 2.1.3 实验分组31
• 2.1.4 转染方法31-32
• 2.1.5 RT-PCR检测转染效率32-33
• 2.1.6 CCK-8 检测细胞增殖活性33-34
• 2.1.7 流式细胞术检测细胞周期改变34
• 2.1.8 RT-PCR检测细胞内Caspase3、Caspase7 mRNA的变化34-35
• 2.1.9 统计学处理35
• 2.2 结果35-41
• 2.2.1 Livin-shRNA对Livin mRNA表达的影响35
• 2.2.2 Livin-shRNA对细胞增殖的影响35-36
• 2.2.3 Livin-shRNA对细胞周期的影响36-37
• 2.2.4 Livin-shRNA对Caspase3、Caspase7 m RNA表达的影响37-41
• 2.3 讨论41-48
• 2.3.1 RNA干扰技术与病毒载体41-43
• 2.3.2 Livin基因与细胞凋亡43-46
• 2.3.3 Livin基因与细胞周期46-48
• 2.4 小结48-49
• 三、裸鼠皮下种植瘤的建立与体内增殖活性检测49-63
• 3.1 对象和方法49-52
• 3.1.1 实验试剂和材料49
• 3.1.2 皮下种植瘤的建立49-50
• 3.1.3 种植瘤的病理学检测50-51
• 3.1.4 RT-PCR检测Livin、Caspase3和Caspase7 mRNA的表达51-52
• 3.2 结果52-59
• 3.2.1 胶质瘤TJ905细胞种植瘤模型的建立及病理学特点52-54
• 3.2.2 Livin-shRNA对胶质瘤TJ905细胞种植瘤模型的影响54
• 3.2.3 Livin-shRNA对Livin、Caspase3和Caspase7 mRNA的影响54-59
• 3.3 讨论59-62
• 3.4 小结62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-71
• 发表论文和参加科研情况说明71-72
• 综述 胶质瘤干细胞的研究现状72-83
• 综述参考文献79-83
• 致谢83

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1 冯嵩;胶质瘤TJ905干细胞Livin-ShRNA裸鼠皮下种植瘤模型的建立及其对Caspase-3,7的影响[D];天津医科大学;2015年

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本文编号：289627