外周血中血脑屏障损伤新型标志物cBMECs检测方法的建立和临床应用

发布时间：2017-04-07 11:02

  本文关键词：外周血中血脑屏障损伤新型标志物cBMECs检测方法的建立和临床应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：一、研究背景全球范围内中枢神经系统(CNS)疾病的致残率一直居高不下,有调查显示全世界有1/3的人将会有CNS损伤的可能,而且CNS损伤的概率随年龄增加而增加。血脑屏障(BBB)是大脑中枢的天然保护伞,其形态、功能的微小改变皆能给病原入侵中枢神经系统带来可乘之机,BBB相关的疾病所致的住院率和预后时间延长均高于其他疾病。实验研究发现,BBB的损伤在中枢神经系统感染的发生过程中有关键作用。中枢神经系统疾病往往伴随BBB结构和功能的剧烈变化。因此监视、检测BBB的形态、功能的细微变化可以预测中枢神经系统感染损伤,对临床早期诊断、治疗有重要意义,也成为诊断、治疗、预防CNS损伤相关疾病的重要突破点。BBB损伤的定量检测曾经是CNS损伤检测的难点所在。成功分离和培养脑微血管内皮细胞(BMECs,BBB的体外模型)使得BBB损伤的致病机制研究(感染及药物所致)成为可能。过去几十年间,学者们采用了许多体内实验方法检测BBB的功能：循环血中的蛋白(如白蛋白)渗透进入中枢神经系统、中枢神经系统中的蛋白(如S100B)释放入循环血等都用来检测BBB损伤。虽然这些技术都利用了内源性蛋白,但是BBB的破坏可能并非仅与某些特异性结果引起的蛋白水平改变相关。近来基于分子成像技术的MPI在神经科学领域受到广泛关注。虽然学者们在体外实验中使用了许多合成造影剂,但是很少能在活体动物脑部得到稳定结果。神经影像技术的最大难题在于显影剂很少能够成功通过BBB。其他的技术包括注射染色,如依文思蓝染色,注射进入动物模型来检测BBB完整性。这些技术的共同缺憾在于它们都不能被无创地运用于人体。近年来的研究发现,外周血中循环内皮细胞(cECs)的多少可反映因心血管损伤和免疫疾病而引起的血管内皮损伤程度,该技术因其新颖性和无创性备受关注。大多cECs定量程序都包括一道富集步骤：通过磁珠偶联抗体进行免疫磁性分离。在外周血中循环的内皮细胞中,一些是终极分化的细胞(cECs),另外一些是前体样细胞(EPCs),EPCs可能参与诱导引导至靶位点的新血管形成。这些文献更多的讲述cECs在病理条件下被大量检测到,cECs可以作为血管损伤性疾病或某些免疫相关疾病的标志物。由此我们得到启发,既然BBB主要由一种特殊的内皮细胞(BMECs)组成,那么BBB受损后,脱落至循环中的BMECs,即cBMECs,可以看做是BBB损伤的生物标志物。基于BBB损伤和CNS的长期研究,我们假设cBMECs有成熟的BBB细胞型,在CNS的病理改变的脑微血管结构中动态脱落。外周血中的BMECs可以用实验手段进行检测,作为提示BBB损伤的生物标志物。二、研究方法1、磁珠活化与UEAI相偶联吸附外周血内皮细胞称取粘附素UEA-I溶于0.5M pH9.5硼酸盐缓冲液中,以0.2mg/ml比例震荡至充分溶解。加入等体积的浓度为4×108/mL的免疫磁珠,充分混匀后,置于室温充分地颠倒震荡,摇动孵育24小时,使免疫磁珠Dynabeads M-450 Tosylactivated与磁珠包被物Ulex europaeus I (UEA I) lectin充分接触,形成稳定连接复合物。经过孵育,将混合物置于磁力架上,在磁力作用下用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液反复冲洗,弃去上清,借助磁力保留免疫磁珠,洗涤三到五次为宜。弃去上清后的磁珠用含0.1%胎牛血清的0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液重悬,放于4℃保存过夜。次日取出置于4℃的磁珠悬液,放在磁力架上弃去上清液体,用含有5%胎牛血清的Hanks缓冲液重悬磁珠至4×108/mL待用。2、免疫磁珠吸附外周血样本中的目的细胞应用真空采血针采集肘正中静脉血,采集2m1静脉血加入EDTA抗凝管,并在采集后的24小时内进行磁珠吸附。取2mL待测样品外周血液与20mL含有5U肝素的磷酸盐缓冲液与离心管中充分混合。将混合物放入离心机,以3000rpm的转数充分离心5分钟。去除上清后,加入20mL盖氏平衡盐溶液,静置5-10分钟。加入磷酸盐缓冲液后再次离心,转数为3000rpm离心5分钟,如果还有肉眼可见红细胞,可重复一次红细胞溶解步骤。离心后去除上清,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,重悬待用。取已去除红细胞的检测样品与等体积的0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液混合后,混合液置于15mL离心管充分混匀。加入上述己连接活化好的免疫磁珠与样品充分混匀,置于分子杂交仪上旋转震荡使免疫磁充分吸附血液样本中的目的细胞。取出离心管置于磁力架上,在磁力的作用下弃去上清液,用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液反复洗涤3次,用枪头反复冲刷洗涤。重悬至澄清,最终得到50u1液体,涂片后普通显微镜下检测免疫磁珠上是否有细胞吸附。3免疫荧光三重染色法鉴别三种目的细胞将重悬的细胞样本均匀得铺在玻片上,形成单层,待染色。待标本涂片半干,在室温下加入4%多聚甲醛溶液固定标本。待标本固定完成后,用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液轻柔洗涤标本三次,用吸水纸吸取多余液体,晾至半干。用0.1%Triton X-100溶液,于室温下对标本进行透化10十分钟。透化完成,用0.01Mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液轻柔洗涤标本三次,用吸水纸吸取多余液体,晾至半干。用5%牛血清白蛋白对涂片进行封闭,并置于37℃孵箱中孵育30分钟。取出玻片,用吸水纸吸去剩余的液体。用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液轻柔洗涤标本三次,用吸水纸吸取多余液体,晾至半干。准备湿盒,对待用抗体进行稀释。对玻片上待测区域进行画圈后,滴加100uL稀释好的一抗待其铺满全片后,将涂片放在湿盒里孵育,置于冰箱中4℃过夜。次日取出湿盒放于37℃培养箱中复温1小时。用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液轻柔洗涤标本三次后,用吸水纸吸取多余液体,晾至半干,准备孵育二抗。此步骤及以后步骤皆避光操作。在暗室对二抗进行稀释,在避光条件下加入稀释好的二抗100uL,待其铺满全片后,将玻片放回湿盒中,在37℃培养箱中孵育2小时。孵育完成后,取出玻片在避光的条件下用0.01Mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液轻柔洗涤标本三次后,用吸水纸吸取多余液体,稍稍晾干。于玻片待测范围滴加DAPI溶液进行细胞核染色,待其覆盖全片后,立即封片,注意避免产生气泡影响观察。在荧光显微镜下采集图像。4、根据三种内皮细胞独特的细胞学表型进行细胞计数在荧光显微镜下采集图像,对目的细胞进行鉴别与计数。通过免疫磁珠在外周血标本中成功捕捉目的细胞,经过涂片和免疫荧光染色方法,根据三种内皮细胞的不同细胞表型(cBMECs的细胞型为DAPI+/CD146+/S100B+, cECs的细胞型为DAPI+/CD146+/S100B-, EPCs的细胞型为DAPI+/CD146+/CD133+/S100B-)进行三种细胞的鉴别和细胞计数。5、统计学处理结果用均数±标准差(X±S)表示,统计方法采用SPSS 13.0统计软件中的独立t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)、相关性分析等方法,取P0.05时,差异有统计学意义。三、结果1、免疫磁珠吸附分离外周血中的目的细胞将免疫磁珠吸附的目的细胞涂片后,把涂片放在普通显微镜下可看到：涂片中散在分布着免疫磁珠,它们是体型微小、圆形的折光性强的颗粒。对视野进行搜寻可见零星分布着明显的细胞形态的物体,一个细胞上往往吸附了多粒免疫磁珠。2、分离的三种目的细胞的免疫荧光三重染色结果取阴性对照样本进行免疫磁珠吸附和免疫荧光三重染色,实验结果显示在四种波长的激发光下均未发现明显细胞形态物体出现。对病例组样本在荧光显微镜下切换各色滤光片,可见同一视野下同一位点有DAPI+/CD146+/S100B+的细胞,即为cBMECs细胞；DAPI+/CD146+/S100B-的细胞,即为cECs细胞；DAPI+/CD146+/CD133+/S100B-的细胞,即为EPCs细胞。3、艾滋脑病病人与阴性对照的外周血中目的细胞计数比较根据cBMECs细胞、cECs细胞及EPCs细胞经过免疫荧光三重染色后在荧光显微镜下呈现颜色的不同,分别计数这三种细胞在艾滋脑病病人外周血和健康对照组外周血中的含量进行比较。艾滋脑病病人外周血cBMECs细胞计数高于健康对照组,用独立t检验进行统计分析,差异具有统计学意义(t=4.92,P0.05)；艾滋脑病病人外周血中cECs细胞(t=8.29, P0.05)、EPCs(t=5.48, P0.05)细胞计数亦然。4、脑膜炎病人与阴性对照外周血中的目的细胞计数比较对cBMECs细胞、cECs细胞及EPCs细胞进行免疫荧光三重染色,在荧光显微镜下根据荧光颜色的不同,分别计数这三种细胞在脑膜炎病人外周血细胞计数进行比较。脑膜炎病人外周血中cBMECs计数高于阴性对照组,经独立t检验,差别有统计学意义(t=11.18,P0.05)。脑膜炎病人外周血中cECs细胞(t=15.03, P0.05、EPCs(t=9.89, P0.05)细胞计数亦然。5、非感染性脑外伤病人与阴性对照外周血中的目的细胞计数比较对cBMECs细胞、cECs细胞及EPCs细胞进行免疫荧光三重染色,在荧光显微镜下根据荧光颜色的不同,分别计数这三种细胞在非感染性脑外伤病人外周血细胞计数进行比较。非感染性脑外伤病人外周血中cBMECs计数高于阴性对照组,经独立t检验,差别有统计学意义(t=4.02,P0.05)。非感染性脑外伤病人外周血中cECs细胞(t=8.75, P0.05)、EPCs(t= 5.16, P0.05)细胞计数亦然。6、艾滋脑病病人、脑膜炎病人与非感染性脑外伤病人外周血中的三种目的细胞计数比较对cBMECs细胞、cECs细胞及EPCs细胞进行免疫荧光三重染色,在荧光显微镜下根据荧光颜色的不同,分别计数这三种细胞在艾滋脑病、脑膜炎及非感染性脑外伤病人外周血细胞计数进行比较。结果显示,脑膜炎组和艾滋脑病组外周血中cBMECs计数高于非感染性脑外伤组,经单因素方差分析检验,差别有统计学意义(F=6.99,P0.05),后续两两比较结果为艾滋脑病组外周血cBMECs计数与脑膜炎组无显著差异(P0.05)。脑膜炎病人外周血中cECs细胞(F=3.77, P0.05)、EPCs(F=28.76, P0.05)细胞计数显著高于其他两组,后续两两比较结果显示艾滋脑病组EPCs细胞计数显著高于非感染性脑外伤组(P0.05),但cECs细胞计数没有显著差异(P0.05)。7、艾滋脑病组血中HIV病毒载量与cBMECs含量的关系采集艾滋脑病患者血中HIV病毒载量信息与其对应外周血cBMECs计数做相关性分析。以HIV病毒载量为纵坐标,cBMECs含量为横坐标做散点图,可见cBMECs含量随HIV病毒载量的增加而增加,统计结果显示此线性相关关系具有统计学意义(r=0.93,P0.05)。8、脑膜炎组外周血cBMECs含量与脑脊液白细胞计数结果的相关性分析采集脑膜炎病人的脑脊液检查信息,以脑脊液白细胞计数与相应外周血cBMECs计数做相关性分析。以脑膜炎病人脑脊液白细胞计数为纵坐标, cBMECs含量为横坐标做散点图,可见脑膜炎病人脑脊液白细胞含量随外周血cBMECs含量的增加而增加,统计结果显示此线性相关关系具有统计学意义：r=0.91,P0.05。9、脑膜炎组外周血cBMECs含量与脑脊液总蛋白含量结果的相关性分析采集脑膜炎病人的脑脊液检查信息,以脑脊液总蛋白含量与相应外周血cBMECs计数做相关性分析。以脑膜炎病人脑脊液总蛋白含量为纵坐标,cBMECs含量为横坐标做散点图,可见脑膜炎病人脑脊液总蛋白含量随外周血cBMECs含量的增加而增加,统计结果显示此线性相关关系具有统计学意义：对r=0.92,P0.05。四、结论1、本课题应用免疫磁珠分离技术从外周血标本中分离出内皮细胞；2、建立了检测人外周血中BBB损伤新型标志物cBMECs的方法；3、病例组外周血中cBMECs计数显著高于健康对照组,提示病例组存在BBB损伤,有BMECs变性、脱落。4、病例组外周血中cECs计数、EPCs计数均显著高于健康对照组,提示病例组存在内皮细胞受损,内皮修复功能增强；5、艾滋脑病病例和脑膜炎病例外周血cBMECs计数显著高于非感染性脑外伤组,验证外周血cBMECs计数反映BBB损伤程度,可以作为BBB损伤的外周血中的指示物。6、外周血cBMECs计数与艾滋脑病组血中HIV病毒载量、脑膜炎组脑脊液中白细胞计数和总蛋白含量均呈正相关关系,验证了外周血cBMECs计数的确可以反应中枢神经系统感染。
【关键词】：血脑屏障损伤 生物标志物 cBMECs 外周血 检测
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-24
• 第一章 外周血中BBB损伤新标志物cBMECs检测方法建立24-37
• 1.1 材料25-27
• 1.2 方法27-29
• 1.3 结果29-34
• 1.4 讨论34-37
• 第二章 外周血中BBB损伤新型标志物cBMECs检测的临床应用37-54
• 2.1 材料37-40
• 2.2 方法40-42
• 2.3 统计学处理42
• 2.4 结果42-49
• 2.5 讨论49-54
• 全文总结54-59
• 参考文献59-65
• 附录65-68
• 英文缩略词表68-69
• 攻读学位期间发表论文69-70
• 致谢70-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 何磊;郭雅飞;李智洋;何农跃;;免疫磁珠的制备[J];化工时刊;2008年07期

2 刘先桥,官月平,邢建民,马志亚,刘会洲;磁性微球的制备及在细胞分离中的应用[J];化学通报;2004年10期

3 邹自英;朱冰;汤雪晴;曾平;汪璐;;脑脊液各项指标联合检测对颅内细菌感染的诊断价值[J];西南军医;2012年02期

  本文关键词：外周血中血脑屏障损伤新型标志物cBMECs检测方法的建立和临床应用，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：290277