丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤自噬的影响及其机制研究

发布时间：2017-04-07 14:00

  本文关键词：丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤自噬的影响及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过丁苯酞、SP600125(JNK的特异性抑制剂)对缺血再灌注大鼠模型进行干预,借助Western blot、HE染色、TUNEL、透射电镜等实验方法,探讨丁苯酞对缺血再灌注损伤后自噬的影响及其与自噬相关蛋白Beclin-1,LC3-Ⅱ的变化;JNK3信号通路是否参与缺血再灌注损伤中自噬的调控;丁苯酞对自噬的影响是否通过JNK3信号通路来调控的。方法:将100只(250-300)g健康雄性SD大鼠随机分为五组:假手术组、模型组、丁苯酞干预组、SP600125组、丁苯酞+SP600125组。每组20只大鼠。丁苯酞组及丁苯酞+SP600125组于造模前一星期开始每天给予8 mg·m L-1的NBP溶液1 m L·100 g-1灌胃;假手术组、SP600125组、模型组给予单纯麻油1 m L·100 g-1。同时SP600125组及丁苯酞+SP600125组予以SP600125与40%PEG400配成1mg·m L-1溶液1 m L·100 g-1腹腔注射给药。假手术组、模型组、丁苯酞组予以同等剂量(40%PEG400)1 m L·100 g-1腹腔注射。Longa线栓法制作大鼠MCAO模型缺血2小时再灌注12小时。使用Longa评分法评价神经功能缺损;分别采用TTC染色判断缺血再灌注模型是否成功;HE染色检测脑组织病理变化;血清NSE含量评估脑缺血再灌注损伤后脑功能的损害;原位末端脱氧核昔酸转移酶标记法(TUNEL)检测缺血再灌注损伤后CA1区神经细胞凋亡与坏死;通过透射电镜观察缺血再灌注损伤后CA1区神经细胞内自噬体形态、数量;WesternBlot检测大鼠CA1区自噬相关蛋白Beclin-1,LC3-Ⅱ的表达和JNK3信号通路相关蛋白JNK3,p-JNK的表达。结果:1.Longa评分:(1)首次评分:假手术组未见神经功能缺损症状。模型组(2.00±0.82)较假手术组(0)明显升高,差异有统计学意义(p0.05);NBP治疗组(1.83±0.50)、SP600125组(1.88±0.52)及NBP+SP600125组(1.85±0.41)三组两两比较,差异无统计学意义(p0.05),但分别与模型组比较,差异均有统计学意义(p0.05)。(2)缺血再灌注12小时后评分:模型组(2.65±0.50)分别与首次评分及假手术组(0)比较均明显升高,差异有统计学意义(p0.05);NBP治疗组(1.53±0.52)、SP600125组(1.55±0.43)及NBP+SP600125组(1.58±0.55)三组两两比较,差异无统计学意义(p0.05),但较模型组及首次评分均明显降低,差异有统计学意义(p0.05)。2.TTC染色:假手术组脑组织染色为鲜红色,模型组、丁苯酞组、丁苯酞+SP600125组、SP600125组均可见皮层及皮层下有明显的白色梗死灶,各组相对梗死灶体积分别为:模型组(25.56±1.86)较假手术组(0)比较,差异有统计学意义(p0.01);丁苯酞组(18.26±2.23),丁苯肽+SP600125组(17.86±2.12),SP600125组(17.98±2.52)三组间两两比较,差异无统计学意义(p0.05),但分别与模型组比较,差异有统计学意义(p0.05)。3.HE染色:各组海马CAl区变化:假手术组,神经元排列整齐,形态圆形较规整,数量正常,胞浆均匀红染,核大而圆呈淡蓝色,核膜边界清晰;模型组,神经元排列紊乱,数量显著降低,胞浆皱缩空泡形成,胞核固缩呈蓝紫色;丁苯酞组、丁苯酞+SP600125组、SP600125组三者两两比较无明显差异,可见大量神经元存活,边界尚清,形态较规整,胞核形状较规则边界清晰,少数细胞出现核染色加深,胞浆部分消失等变性表现。4.TUNEL染色:各组海马CAl区神经元凋亡表达量为:模型组(0.52±0.05)分别与假手术组(0.05±0.02)、丁苯酞组(0.31±0.03)、SP600125组(0.30±0.02)以及丁苯酞+SP600125组(0.32±0.04)明显升高,差异有统计学意义(p0.05)。丁苯酞组(0.31±0.03)、SP600125组(0.30±0.02)以及丁苯酞+SP600125组(0.32±0.04),三组之间两两比较,差异无统计学意义(p0.05)。5.NSE-ELISA测定:假手术组(1.89±0.13)、丁苯酞组(5.10±0.15)、SP600125组(5.21±0.11)以及丁苯酞+SP600125组(5.05±0.15)分别与模型组(9.83±0.21)比较,结果表明血清NSE含量均低于模型,差异有显著统计学意义(p0.01)。而丁苯酞组、SP600125组以及丁苯+SP600125组三者之间两两比较,差异无统计学意义(p0.05)。6.westem blot:实验结果示:p-JNK、JNK、Beclin-1、LC3-Ⅱ水平模型组比丁苯酞组、SP600125组、丁苯酞+SP600125组、假手术组(A组)比较,差异有统计学意义(p0.05)。而丁苯酞组、SP600125组、丁苯酞+SP600125组三者之间两两比较,差异无统计学意义(p0.05)。7.透射电镜:各组CA1区电镜:假手术组神经细胞结构基本正常,线粒体无肿胀,未见自噬体;模型组可见泡状的自噬溶酶体,神经元细胞核染色质固缩;丁苯酞组、SP600125组、SP600125+丁苯酞组可见双层膜结构形成,包绕细胞器形成自噬体,少量圆形溶酶体,大多位于细胞核旁,同时可见初级溶酶体、次级溶酶体数量增多以及线粒体肿胀。结论:1.大鼠脑缺血再灌注损伤后可诱发自噬的过度激活;2.JNK3信号通路参与了大鼠脑缺血再灌注损伤中对自噬的调控;3.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用与自噬现象有关;其主要是通过下调JNK3、p-JNK的表达减弱脑缺血再灌注诱发的过度自噬而发挥神经保护作用。
【关键词】：丁苯酞 脑缺血再灌注 自噬 JNK信号通路 SP600125
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 中英文缩略词表16-17
• 第一章 前言17-19
• 第二章 材料和方法19-27
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 主要仪器19
• 2.1.2 主要耗材19-20
• 2.1.3 溶液配置20-21
• 2.2 实验方法21-26
• 2.2.1 实验动物分组21
• 2.2.2 大鼠MCAO再灌注模型制作21-23
• 2.2.3 TTC染色23
• 2.2.4 大鼠大脑的固定制作23
• 2.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡23
• 2.2.6 石蜡包埋及切片制作23-24
• 2.2.7 HE染色24
• 2.2.8 Western blot24-25
• 2.2.9 血清NSE检测25
• 2.2.10 透射电镜25-26
• 2.4 动物伦理26
• 2.5 统计学分析26-27
• 第三章 结果27-32
• 3.1 模型评估27
• 3.2 TTC 染色结果27-28
• 3.3 海马组织CA1区神经元HE染色观察28
• 3.4 NSE 水平28-29
• 3.5.海马组织CA1区神经元TUNEL染色观察29
• 3.6 Western Blot蛋白检测29-31
• 3.7 透射电镜31-32
• 第四章讨论32-38
• 4.1 动物模型的评价32-33
• 4.2 脑缺血再灌注后自噬的激活33-34
• 4.3 JNK3信号通路与脑缺血再灌注损伤34
• 4.4 作用机制34-36
• 4.5 展望36-38
• 第五章 结论38
• 参考文献38-42
• 附图42-51
• 综述51-59
• 参考文献55-59
• 研究生期间参与的科研项目及发表的论文59-60
• 致谢60

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