耗竭NAD联合2-DG增加脑胶质瘤U87细胞放射敏感性及其机制研究

发布时间：2017-04-07 15:16

  本文关键词：耗竭NAD联合2-DG增加脑胶质瘤U87细胞放射敏感性及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：本课题主要通过沉默胶质瘤细胞NAMPT基因(NAD+应急合成途径限速酶)或者外源性加入NAD+影响细胞内NAD+含量,探讨2-脱氧葡萄糖(2-DG)诱导的NAD+含量增加,在维持细胞能量代谢、氧化还原水平以及存活的关键作用机制,为进一步在2-DG处理下耗竭细胞内NAD+诱导细胞死亡、放射增敏提供理论依据。方法：1.在2-DG诱导的U87细胞代谢适应的研究中,Western blot法观察不同浓度2-DG培养条件下,NAMPT的表达以及caspase3活化的改变,使用NAD+检测试剂盒观察NAD+含量变化,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平；2.在NAD+介导2-DG处理下的代谢适应的研究中,小干扰RNA-NAMPT (siNAMPT)或外源性加入NAD预处理U87细胞,流式细胞仪检测DCFH染色的细胞内ROS水平,NADPH试剂盒检测细胞内NADPH水平；再联合2-DG处理条件下,ATP试剂盒检测细胞内ATP含量变化,流式细胞仪检测Annexin-V或PI染色后U87细胞凋亡变化,Westenn blot法观察caspase 3活化情况；3.在耗竭NAD+联合2-DG增加胶质瘤U87细胞杀伤研究中,使用小干扰RNA-NAMPT (siNAMPT)或杂乱RNA转染U87细胞再联合2-DG处理,流式细胞仪检测Annexin-V-FITC以及PI双染的细胞阴性水平。4.在耗竭NAD+联合2-DG增加胶质瘤U87细胞放射敏感性研究中,实验分组为si-scramble RNA+IR、si-scramble RNA+2-DG+IR、siNAMPT+IR、siNAMPT+2-DG+IR,4Gy X射线照射,14天后,计数克隆形成水平；与克隆形成实验分组相同,激光共聚焦显微镜观察γH2AX抗体孵育的U87细胞X线照射后0,4,10,24小时DNA双链断裂数目。结果：1.单纯2-DG处理条件下,Western blot结果显示U87细胞NAMPT蛋白表达升高,NAD+检测结果显示U87细胞内NAD+含量增加,流式细胞仪检测U87细胞DCFH荧光强度减弱,同时Western blot结果显示2.5,5,10mM2-DG组相比对照组,caspase 3活化水平呈浓度依赖性下降；2.ATP试剂盒检测结果显示2-DG处理组比对照组ATP含量显著下降,siNAMPT+2-DG处理组比2-DG处理组ATP含量显著下降,2-DG+exNAD处理组比2-DG处理组ATP含量上升,证明2-DG诱导的NAD+增加参与维持细胞内的ATP含量；流式细胞仪检测U87细胞]DCFH荧光计数,结果显示2-DG、exNAD处理组与对照组相比,细胞内ROS含量下降超过对照组的50%; FK866、siNAMPT处理组与对照组相比,细胞内ROS含量上升超过对照组的25%,证明NAD+参与细胞内ROS水平的调节；NADPH试剂盒检测结果显示2-DG、exNAD处理组与对照组相比,细胞内NADPH含量显著上升；FK866、siNAMPT处理组与对照组相比,细胞内NADPH下降,证明2-DG诱导的NAD+增加通过NAD+-NADPH过程参与细胞内ROS调控。Western blot结果显示2-DG、NAD+处理组比对照组cleaved caspase 3表达降低,siNAMPT处理组比对照组cleaved caspase 3表达增加,siNAMPT+2-DG处理组比2-DG处理组cleaved caspase 3表达增加,siNAMPT+2-DG+exNAD处理组比siNAMPT+2-DG处理组降低caspase 3活化但仍然高于2-DG处理组,证明2-DG诱导的NAD+增加参与下调细胞内凋亡过程；3.流式细胞仪检测Annexin-V-FITC以及PI双染的细胞阴性水平结果显示siNAMPT+2-DG处理组对比si-scramble RNA+2-DG处理组在2-DG处理组细胞存活明显下降,siNAMPT+2-DG+exNAD处理组比siNAMPT+2-DG处理组细胞存活上升但仍低于si-scramble RNA+2-DG处理组。4.克隆形成实验显示siNAMPT+2-DG处理组的细胞比si-scramble RNA、siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG组克隆形成显著减少,siNAMPT+2-DG处理组放射增敏比为1.64,siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG组放射增敏比为1.30,1.23,证明耗竭NAD+显著增加胶质瘤U87细胞放射敏感性。激光共聚焦检测γH2AX染色的DNA双链断裂结果为siNAMPT+2-DG组比si-scramble RNA、siNAMPT、si-scramble RNA+2-DG组在4小时、10小时时间点的DNA双链断裂的数目无明显统计学差异；在24小时时间点,siNAMPT+2-DG组DNA双链断裂明显增多,超过2-DG处理组的40%,si-scramble RNA组24小时的DNA双链断裂已经基本消失,该结果提示siNAMPT+2-DG组有效影响电离辐射后DNA损伤修复进程,增加U87细胞X线照射后的DNA损伤。结论：成功验证了NAD+-增加有利于维持U87细胞ATP稳态,降低细胞内ROS以及抑制caspase 3的活化；进一步研究表明抑制NAD+联合2-DG能够有效杀伤胶质瘤U87细胞,提高U87细胞的放射敏感性,该研究结果未见相关文献报道。
【关键词】：2-DG NAD~+ 代谢适应 脑胶质瘤细胞 细胞杀伤 放射增敏
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41;R730.55
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-12
• 第一部分：NAD~+对2-DG诱导代谢适应的影响12-38
• 一、2-DG对胶质瘤U87细胞的能量代谢、氧化还原平衡以及凋亡的影响12-21
• 二、2-DG对胶质瘤U87细胞的NAD~+含量以及NAMPT基因表达影响21-25
• 三、2-DG处理下的NAD~+增加对胶质瘤U87细胞能量代谢、氧化还原平衡以及凋亡的影响25-38
• 第二部分：耗竭NAD~+对2-DG处理下的细胞存活以及放射敏感性的影响38-51
• 一、耗竭NAD~+对2-DG处理下的胶质瘤U87细胞存活的影响38-43
• 二、耗竭NAD~+对2-DG处理下的胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响43-51
• 参考文献51-57
• 综述57-67
• 参考文献62-67
• 英文缩略词表67-68
• 攻读学位期间本人公开发表的论文及获得专利68-70
• 致谢70-72

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