EAMG大鼠胸腺CD4SP细胞S1P-S1P1信号调控Th17细胞分化
发布时间：2020-12-11 10:00
背景与目的1型1磷酸鞘氨醇受体（Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1）是G蛋白偶联受体超家族表达最多和最广泛的受体之一,在成人体内高表达于免疫器官、肺和脑等组织,在肾脏中表达较低。利用抗S1P1抗体对小鼠胸腺进行免疫组织化学染色显示,S1P1主要在胸腺髓质区的胸腺细胞表面表达。胸腺髓质区分布的细胞主要是单阳性胸腺细胞,Michael A等认为单阳性T细胞从胸腺迁出是由其高表达的S1P1与S1P特异性识别结合介导的。S1P1的表达受转录因子叉头蛋白O1（Forkhead Box transcription O1,FoxO1）的调控。在哺乳类动物中,FoxO1高表达于成熟的T、B淋巴细胞,并且可以调节T细胞的分化及功能。FoxO1在胸腺细胞发育为单阳性细胞的早期表达升高,引起S1P1的表达,直至胸腺细胞成熟迁出胸腺。项目组前期关于重症肌无力（myasthenia gravis,MG）的研究发现在MG患者胸腺组织中转录因子FoxO1和S1P1在RNA水平和蛋白水平均高于正常对照组,提示FoxO1可能通过调节S1P1表达与MG的发生发展有关。S1P/S...
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胸腺细胞和淋巴结细胞的FACS分析方法
图 2.2 FoxO1-重组载体图谱注：a：FoxO1-过表达载体图谱；b：FoxO1-shRNA 载体图谱2.2. 7.5 重组载体的扩增大肠杆菌感受态 DH5α细胞的制备：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理细胞膜的通透性发生变化，能容许外源 DNA 的载体分子通过，称为感受态细取 DH5α菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养基的 500ml 烧瓶中，37℃（200-300r/min）2-3h 至 OD 值 0.5-0.6，无菌条件下把菌液倒入 50ml 离心管在 4℃下 4 100 r/min 离心 10 min。加入 bufferA 重悬，4℃下 4 100 r/min 离min，buffer B 重悬。重组质粒转化入大肠杆菌感受态 DH5α细胞：将构建好的重组质粒加入装有感受态 DH5α管内，冰上放置 30min，42浴热激 30-60s，热激后立即放置冰上 5min；加入 1ml LB 培养基，37℃，≤摇菌 1h；4000-5000r 离心 5min，残留 20-30ul 上清，吹打摇匀，转化菌涂氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选，37℃培养过夜。
3 结果3.1 EAMG 鼠模型的鉴定6-8 周雌性 Lewis 大鼠经过 AchR 多肽免疫，在第 3 次免疫后进行功能评分，EAMG 鼠模型功能评分标准：0 分，肌肉力量无异常；1 分，抓取无力，活动轻度减少，易疲劳；2 分，大鼠活动明显减少，行走不稳，休息时身体成隆起姿势，头尾下垂，前肢屈曲，震颤；3 分，大鼠严重全身无力，无抓取、撕咬动作，身体震颤，濒死状态；4 分：大鼠死亡。评分结果：0 分，2 只；1 分，13 只；2分，5 只；3 分，0 只；4 分，0 只。与对照组相比，EAMG 鼠模型伴随着评分的升高，肌电波幅下降。选取评分为 1 分和 2 分的大鼠采眼眶血分离血清，ELISA法测抗 AchR 抗体，结果如图 3.1 显示 EAMG 组 OD 值明显增高（EAMG 组0.97 ± 0.09，对照组 0.12± 0.01，P<0.05），且 ODEAMG组/OD对照组>2。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Foxo1-KLF2-S1P1在MG患者胸腺组织的表达[J]. 张云,赵俊涛,刘萍萍,轩小燕,朱郑坤,马莹莹,李倩如,杜英. 免疫学杂志. 2015(02)
[2]Involvement of Sphingosine 1-Phosphate （S1P） Receptor Type 1 and Type 4 in Migratory Response of Mouse T Cells toward S1P[J]. Hirofumi Matsuyuki,Yasuhiro Maeda,Kazuhiro Yano,Kunio Sugahara,Kenji Chiba,Takayuki Kohno,Yasuyuki Igarashi. Cellular & Molecular Immunology. 2006(06)
[3]Role of Sphingosine 1-Phosphate Receptor Type 1 in Lymphocyte Egress from Secondary Lymphoid Tissues and Thymus[J]. Kenji Chiba,Hirofumi Matsuyuki,Yasuhiro Maeda,Kunio Sugahara. Cellular & Molecular Immunology. 2006(01)
本文编号：2910339
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胸腺细胞和淋巴结细胞的FACS分析方法
图 2.2 FoxO1-重组载体图谱注：a：FoxO1-过表达载体图谱；b：FoxO1-shRNA 载体图谱2.2. 7.5 重组载体的扩增大肠杆菌感受态 DH5α细胞的制备：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理细胞膜的通透性发生变化，能容许外源 DNA 的载体分子通过，称为感受态细取 DH5α菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养基的 500ml 烧瓶中，37℃（200-300r/min）2-3h 至 OD 值 0.5-0.6，无菌条件下把菌液倒入 50ml 离心管在 4℃下 4 100 r/min 离心 10 min。加入 bufferA 重悬，4℃下 4 100 r/min 离min，buffer B 重悬。重组质粒转化入大肠杆菌感受态 DH5α细胞：将构建好的重组质粒加入装有感受态 DH5α管内，冰上放置 30min，42浴热激 30-60s，热激后立即放置冰上 5min；加入 1ml LB 培养基，37℃，≤摇菌 1h；4000-5000r 离心 5min，残留 20-30ul 上清，吹打摇匀，转化菌涂氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选，37℃培养过夜。
3 结果3.1 EAMG 鼠模型的鉴定6-8 周雌性 Lewis 大鼠经过 AchR 多肽免疫，在第 3 次免疫后进行功能评分，EAMG 鼠模型功能评分标准：0 分，肌肉力量无异常；1 分，抓取无力，活动轻度减少，易疲劳；2 分，大鼠活动明显减少，行走不稳，休息时身体成隆起姿势，头尾下垂，前肢屈曲，震颤；3 分，大鼠严重全身无力，无抓取、撕咬动作，身体震颤，濒死状态；4 分：大鼠死亡。评分结果：0 分，2 只；1 分，13 只；2分，5 只；3 分，0 只；4 分，0 只。与对照组相比，EAMG 鼠模型伴随着评分的升高，肌电波幅下降。选取评分为 1 分和 2 分的大鼠采眼眶血分离血清，ELISA法测抗 AchR 抗体，结果如图 3.1 显示 EAMG 组 OD 值明显增高（EAMG 组0.97 ± 0.09，对照组 0.12± 0.01，P<0.05），且 ODEAMG组/OD对照组>2。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Foxo1-KLF2-S1P1在MG患者胸腺组织的表达[J]. 张云,赵俊涛,刘萍萍,轩小燕,朱郑坤,马莹莹,李倩如,杜英. 免疫学杂志. 2015(02)
[2]Involvement of Sphingosine 1-Phosphate （S1P） Receptor Type 1 and Type 4 in Migratory Response of Mouse T Cells toward S1P[J]. Hirofumi Matsuyuki,Yasuhiro Maeda,Kazuhiro Yano,Kunio Sugahara,Kenji Chiba,Takayuki Kohno,Yasuyuki Igarashi. Cellular & Molecular Immunology. 2006(06)
[3]Role of Sphingosine 1-Phosphate Receptor Type 1 in Lymphocyte Egress from Secondary Lymphoid Tissues and Thymus[J]. Kenji Chiba,Hirofumi Matsuyuki,Yasuhiro Maeda,Kunio Sugahara. Cellular & Molecular Immunology. 2006(01)
本文编号：2910339
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