C6胶质瘤微环境中BMSCs恶性转化机制的研究

发布时间：2017-04-11 07:13

  本文关键词：C6胶质瘤微环境中BMSCs恶性转化机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目 的通过构建C6胶质瘤细胞与骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal stem cells,BMSCs)的间接共培养模型,探讨C6与BMSCs间接共培养后BMSCs形态变化及其NF-κB与STAT3表达的变化：通过构建恶性转化的BMSCs裸鼠荷瘤模型,并检测肿块组织切片NF-κB与STAT3的表达,验证间接共培养后BMSCs的恶性转化趋势,从而为BMSCs临床应用的安全性提供实验基础及理论依据。材料与方法1.实验动物SPF级SD雄性大鼠,3-4周龄、体重40-10g：裸鼠,雄性,5-6周龄,体重约18-20g。以上实验动物均购买于重庆医科大学实验动物中心。2.细胞来源用骨髓贴壁法筛选和分离培养大鼠BMSCs;取24h新生SD大鼠大脑皮层组织,体外分离培养大鼠星型胶质细胞；C6胶质瘤细胞系由重庆医科大学“儿童发育与疾病研究所”提供；3.实验分组本研究分为两部分,第一部分实验共分4组：实验组,C6胶质瘤细胞二次培养液与含10%胎牛血清DMEM/F12新鲜培养基以1：1比例培养第三代BMSCs(骨髓间充质干细胞),间接共培养7天；阴性对照组,星形胶质细胞二次培养液与10%胎牛血清DMEM/F12新鲜培养基1：1比例培养第三代BMSCs,间接共培养7天；空白组,10%胎牛血清DMEM/F12新鲜培养基培养第三代BMSCs;阳性对照组,10%胎牛血清DMEM/F12培养基培养C6胶质瘤细胞。第二部分实验分为三组： 实验组,裸鼠皮下注射间接共培养后的BMSCs;阳性对照组,裸鼠皮下注射C6脑胶质瘤细胞；空白对照组,裸鼠皮下注射单独培养的BMSCs。4.实验方法4.1骨髓贴壁法分离筛选培养SD大鼠BMSCs,用尼康倒置显微镜镜下观察各组细胞形态。4.2流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测CD29、CD90及CD45的表达情况。4.3 RT-PCR、Western blot、细胞及组织免疫荧光(Immunoflurescence,IF)检测各组NF-κB、STAT3、c-Myc及s-100p的表达情况。4.4细胞迁移实验检测各组细胞的迁移能力。4.5裸鼠皮下成瘤实验检测各组BMSCs在体内的成瘤能力。4.6 HE染色法观察各组裸鼠荷瘤组织形态结构。结果1.FCM结果显示第三代骨髓间充质干细胞CD29、CD90均呈阳性表达,CD45呈阴性表达；显微镜下实验组BMSCs细胞形态发生显著改变,核质比增大,胞体变细长；2.细胞免疫荧光结果显示实验组NF-κB/P65、P-STAT3、s-100β蛋白主要定位于核内,且阳性表达率显著高于空白对照组(P0.05),组织免疫荧光结果显示实验组及阳性组NF-KB/p65、s-100β在胞浆及核内均有表达,P-STAT3表达于细胞核内。3.RT-PCR结果显示实验组NF-KB/p65、STAT3、c-Myc mRNA表达水平显著高于空白对照组(P值0.05)：4. Western blot蛋白结果显示NF-KB/p65、P-STAT3、c-Myc蛋白表达显著高于空白对照组(P0.05)；5.细胞迁移实验结果显示实验组细胞迁移能力显著高于空白对照组(P0.05)：6.裸鼠皮下注射各组BMSCs两周后,实验组及阳性组裸鼠注射部位可见有肿块生长,空白对照组没有肿块生长。取各组注射部位组织,HE染色,可见实验组及阳性对照组有大量无序排列的肿瘤细胞,细胞排列紊乱,并伴有坏死出血。空白对照组HE染色结果显示,接种部位无肿块的生长,保留正常肌肉组织结构。结论1.间接共培养后BMSCs迁移能力显著增强,同时存在肿瘤发生相关的转录因子NF-κB/p65、P-STAT3及胶质瘤特异性蛋白s-100β的高表达。2.间接共培养后的BMSCs能在裸鼠皮下形成荷瘤,且肿瘤组织的NF-KB/p65、P-STAT3及s-100β的表达阳性率与体外间接共培养后的BMSCs表达一致。
【关键词】：BMSCs NF-κB/p65 P-STAT3 C6胶质瘤细胞
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一部分 骨髓间充质干细胞在C6胶质瘤微环境中间接共培养后NF-κB的表达情况14-37
• 1 材料与方法14-24
• 2 结果24-32
• 3 讨论32-34
• 4 结论34-35
• 参考文献35-37
• 第二部分 恶性转化的干细胞裸鼠荷瘤模型的建立及NF-κB和STAT3的表达37-47
• 1 材料与方法37-41
• 2 结果41-44
• 3 讨论44-45
• 4 结论45-46
• 参考文献46-47
• 全文总结47-48
• 文献综述48-56
• 参考文献53-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士学位期间发表学术论文目录57

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  本文关键词：C6胶质瘤微环境中BMSCs恶性转化机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：298590