高灵敏液相色谱-串联质谱研究鞘糖脂类作为神经退行性疾病小鼠模型的生物标志物
发布时间：2021-02-10 03:17
鞘糖脂分子葡萄糖神经酰胺（GluCer）与半乳糖神经酰胺（GalCer）,葡萄糖鞘氨醇（GluSph）和半乳糖鞘氨醇（GalSph）分别为异构体。它们均具有细胞毒性,在中枢神经系统（CNS）中积累会导致溶酶体贮积疾病如戈谢病和克拉伯病,也被证实与帕金森氏病和路易体病密切相关。研究CNS中鞘糖脂对神经科学领域具有重要意义。在本文中,我们改进了基于亲和色谱柱的一种液相色谱方法,设计了一个新颖的梯度,可在10 min内同时分离检测GluCer/GalCer及GluSph/GalSp异构体。而且,该梯度在每次运行后重新活化分离柱,可将灵敏度（相对等度洗脱）提高一个数量级。本方法成功用于分析疾病小鼠模型的生物样品（包括细胞、脑脊髓液、血浆和脑）中的糖鞘脂,结果表明鞘糖脂可作为研究相关神经退行性疾病的高灵敏生物标志物。
【文章来源】：分析科学学报. 2020,36(05)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
(A)LC梯度;(B)小鼠CSF的6种GluCer和GalCer;(C)小鼠CSF的GluSph和GalSph;(D)等度运行,色谱柱灵敏度在分析35个样品后降至10%左右(采用本实验的梯度,柱效在20多个样品后基本完全恢复);(E)内标物LC峰强度对比
2.2 疾病模型小鼠与野生小鼠中GluSph和GalSph含量对比我们研究了几种疾病小鼠模型及野生型小鼠的生物样品,其中包括β -葡糖苷酶抑制剂(CBE)注射的小鼠脑组织,GBA敲除小鼠胚胎成纤维细胞和自然突变的twitcher小鼠的血浆,CBE小鼠和GBA敲除模型用于研究戈谢病(GD)或者帕金森。实验发现在注射10周CBE雄性小鼠的脑中GluSph含量比野生型小鼠脑中上升超过百倍,而GalSph几乎没有变化(图2a和2g)。在GBA敲除的小鼠胚胎成纤维细胞,GluSph和GalSph没有明显变化(图2d和2e)。证实了β -葡糖苷酶GCase的缺失,极大的影响CNS。但在基因敲除的动物体外实验,GCase的抑制尚未达到明显效果。实验还发现12周的twitcher小鼠的血浆中,相对于野生型GalSph增加了近百倍,而GluSph完全没有受到影响(图2b和2c)。充分说明twitcher小鼠模型中GALC的突变,以及这个模型用于研究克拉伯病的有效性,同时说明这些酯类作为疾病通路标志物的可能性[16,17]。
2.3 标准曲线和灵敏度图3显示GluCer(d18∶1/18∶0)相对于2 000 pg内标(即加入每个样品的内标总量,见1.4节),GluCer(d18∶1/18∶0)-d5从3.8 pg到15 625 pg的标准曲线(进样体积5 μL)。结果表明新建立方法的线性范围很宽,达到4个数量级,相关系数R2>0.995,定量限达10 pg,检出限低至3 pg。浓度分别为12 000、1 200及50 pg的高、中、低质控样品,测量准确率不低于85%。脂类的质谱分析中,基于同一类脂离子化效率大致相同,往往使用单一内标来定量不同长度脂肪酸链的分子以减少掺入内标的可能干扰。实验也发现葡萄糖和半乳糖神经酰胺离子化效率也近似相同,故而这个曲线被用于本文中所有的GluCer和GalCer分子定量。文献报道GD模型CSF的含量为280 pmol/mL[18],故5 μL小鼠CSF中GluCer含量约为980 pg。CSF萃取过程是将5 μL 样品稀释到50 μL,再进样5 μL,所以进样量为CSF的1/10。根据标准曲线,进样的GluCer含量约为110 pg,CSF中含量约为1 100 pg,此浓度略高于报道的浓度,远高于我们的定量限(10 pg)。说明了我们新建立的方法的灵敏度很高,而且适用性强,适用于检测低至5 μL的CSF或者20 mg组织中GluCer及GalCer含量。
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖鞘脂分析技术及相关疾病研究进展[J]. 杜昊骐,于汉杰,贾丽苑,李铮. 生物化学与生物物理进展. 2016(01)
本文编号：3026700
【文章来源】：分析科学学报. 2020,36(05)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
(A)LC梯度;(B)小鼠CSF的6种GluCer和GalCer;(C)小鼠CSF的GluSph和GalSph;(D)等度运行,色谱柱灵敏度在分析35个样品后降至10%左右(采用本实验的梯度,柱效在20多个样品后基本完全恢复);(E)内标物LC峰强度对比
2.2 疾病模型小鼠与野生小鼠中GluSph和GalSph含量对比我们研究了几种疾病小鼠模型及野生型小鼠的生物样品,其中包括β -葡糖苷酶抑制剂(CBE)注射的小鼠脑组织,GBA敲除小鼠胚胎成纤维细胞和自然突变的twitcher小鼠的血浆,CBE小鼠和GBA敲除模型用于研究戈谢病(GD)或者帕金森。实验发现在注射10周CBE雄性小鼠的脑中GluSph含量比野生型小鼠脑中上升超过百倍,而GalSph几乎没有变化(图2a和2g)。在GBA敲除的小鼠胚胎成纤维细胞,GluSph和GalSph没有明显变化(图2d和2e)。证实了β -葡糖苷酶GCase的缺失,极大的影响CNS。但在基因敲除的动物体外实验,GCase的抑制尚未达到明显效果。实验还发现12周的twitcher小鼠的血浆中,相对于野生型GalSph增加了近百倍,而GluSph完全没有受到影响(图2b和2c)。充分说明twitcher小鼠模型中GALC的突变,以及这个模型用于研究克拉伯病的有效性,同时说明这些酯类作为疾病通路标志物的可能性[16,17]。
2.3 标准曲线和灵敏度图3显示GluCer(d18∶1/18∶0)相对于2 000 pg内标(即加入每个样品的内标总量,见1.4节),GluCer(d18∶1/18∶0)-d5从3.8 pg到15 625 pg的标准曲线(进样体积5 μL)。结果表明新建立方法的线性范围很宽,达到4个数量级,相关系数R2>0.995,定量限达10 pg,检出限低至3 pg。浓度分别为12 000、1 200及50 pg的高、中、低质控样品,测量准确率不低于85%。脂类的质谱分析中,基于同一类脂离子化效率大致相同,往往使用单一内标来定量不同长度脂肪酸链的分子以减少掺入内标的可能干扰。实验也发现葡萄糖和半乳糖神经酰胺离子化效率也近似相同,故而这个曲线被用于本文中所有的GluCer和GalCer分子定量。文献报道GD模型CSF的含量为280 pmol/mL[18],故5 μL小鼠CSF中GluCer含量约为980 pg。CSF萃取过程是将5 μL 样品稀释到50 μL,再进样5 μL,所以进样量为CSF的1/10。根据标准曲线,进样的GluCer含量约为110 pg,CSF中含量约为1 100 pg,此浓度略高于报道的浓度,远高于我们的定量限(10 pg)。说明了我们新建立的方法的灵敏度很高,而且适用性强,适用于检测低至5 μL的CSF或者20 mg组织中GluCer及GalCer含量。
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖鞘脂分析技术及相关疾病研究进展[J]. 杜昊骐,于汉杰,贾丽苑,李铮. 生物化学与生物物理进展. 2016(01)
本文编号：3026700
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/3026700.html
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