PINK1蛋白磷酸化修饰在帕金森病发病机制中的作用研究

发布时间：2021-03-05 21:25

　　背景：帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是临床上常见的神经退行性疾病之一。PD的临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、步态异常和肌强直,PD的病因与发病机制尚无确切定论,主流研究认为这是一种与衰老、环境及遗传因素密切相关的疾病。PINK1基因（PTEN-induced putative kinase1）是在2004年被克隆的PARK6致病基因,属于常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征的致病基因之一,该基因编码产生一种由581个氨基酸组成有激酶活性的线粒体蛋白,包括一个由34个氨基酸组成的线粒体定位结构域和一个由354个氨基酸组成的激酶结构域,此激酶结构域与Ca2+/钙调蛋白家族的丝氨酸/苏氨酸激酶高度同源。PINK1蛋白首先于2003年被证明它的激酶区域在体外实验中有自磷酸化活性,PINK1蛋白能通过自身磷酸化后,调节其自身的激酶活性；PINK1蛋白也能参与体外磷酸化,如磷酸化组蛋白H1或酪蛋白。有研究发现PINK1基因的致病突变影响了PINK1蛋白的磷酸化。但未有PINK1蛋白自身磷酸化位点体外实验的鉴定研究报道,及PINK1蛋白的自身磷酸化修饰位点改变对其体外激... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
目录
前言
第一节 应用质谱技术鉴定PINK1蛋白自磷酸化修饰位点的研究
    1 材料与仪器
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂、耗材及试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 野生型PINK1原核表达质粒载体的构建
        2.2 大肠杆菌中蛋白质诱导表达
        2.3 平衡G4B（Glutathione Sepharose 4B）
        2.4 GST蛋白的纯化
        2.5 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
        2.6 GST-Tag融合蛋白的大量纯化
        2.7 体外磷酸化反应（In Vitro Phosphorylation Assay）
        2.8 生物质谱技术（北京蛋白质组研究中心）检测磷酸化修饰位点
    3 结果
        3.1 构建野生型PFNK1的原核表达质粒
        3.2 GST-PINK1融合蛋白的大量纯化
        3.3 运用质谱技术鉴定PINK1蛋白的自身磷酸化修饰位点
    4 分析与讨论
第二节 野生型PINK1蛋白自身磷酸化修饰的研究
    1 材料与仪器
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂、耗材及试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 S465A突变型PINK1原核表达质粒载体的构建（TaKaRa MutanBEST Kit）
        2.2 大肠杆菌中蛋白质诱导表达
        2.3 平衡G4B（Glutathione Sepharose 4B）
        2.4 GST蛋白的纯化
        2.5 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
        2.6 GST-Tag融合蛋白的大量纯化
        2.7 体外磷酸化反应（In Vitro Phosphorylation Assay）和放射自显影
        2.8 实验分组
        2.9 数据统计及分析
    3 结果
        3.1 构建S465A突变型PINK1的原核表达质粒
        3.2 GST-PINK1融合蛋白的大量纯化
        3.3 体外磷酸化和放射自显影
    4 分析与讨论
第三节 突变型PINK1蛋白对其激酶活性的影响
    1 材料与仪器
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂、耗材及试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 T313M、R492X突变型PINK1原核表达质粒载体的构建
        2.2 大肠杆菌中蛋白质诱导表达
        2.3 平衡G4B（Glutathione Sepharose 4B）
        2.4 GST蛋白的纯化
        2.5 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
        2.6 GST-Tag融合蛋白的大量纯化
        2.7 体外磷酸化反应（In Vitro Phosphorylation Assay）和放射自显影
        2.8 实验分组
        2.9 数据统计及分析
    3 结果
        3.1 构建T313M、R492X突变型PINK1的原核表达质粒
        3.2 野生型及突变型GST-PINK1融合蛋白的大量纯化
        3.3 野生型和突变型GST-PINK1融合蛋白磷酸化底物酪蛋白的活性的比较
    4 分析与讨论
第四节 突变型PINK1蛋白对于亚细胞定位的影响
    1 材料与仪器
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂、耗材及试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 S465A/S465D突变型PINK1真核表达质粒载体的构建
        2.2 HEK 293细胞培养
        2.3 细胞转染（脂质体转染法）
        2.4 实验分组
        2.5 细胞免疫化学染色
        2.6 细胞的荧光观察
    3 结果
        3.1 构建S465D突变型PINK1的原核表达质粒
        3.2 构建S465A/S465D突变型PINK1的真核表达质粒
        3.3 在荧光显微镜下观察细胞免疫荧光化学染色结果
    4 分析与讨论
第五节 突变型PINK1蛋白对于其自身降解的影响
    1 材料与仪器
        1.1 主要仪器
        1.2 材料与试剂
    2 实验方法
        2.1 HEK 293细胞培养
        2.2 细胞转染（脂质体转染法）
        2.3 实验分组
        2.4 Chase-time
        2.5 Western-blotting
    3 结果
    4 分析与讨论
第六节 突变型PINK1对于Parkin亚细胞定位的影响
    1 材料与仪器
        1.1 主要仪器
        1.2 主要试剂、耗材及试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 HEK 293细胞培养
        2.2 细胞转染（脂质体转染法）
        2.3 实验分组
        2.4 细胞免疫化学染色
        2.5 细胞的荧光观察
        2.6 共转染后含有野生型及突变型PINK1与Parkin共定位的阳性细胞计数
    3 结果
        3.1 荧光显微镜下观察共转染后野生型及突变型PINK1与Parkin的亚细胞定位
        3.2 共转染后含野生型及突变型PINK1与Parkin共定位的阳性细胞计数统计
    4 分析与讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间的主要研究成果目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]帕金森病相关蛋白Parkin与PINK1的相互作用研究[J]. 王雪晶,郭纪锋,江泓,沈璐,唐北沙.  生物化学与生物物理进展. 2010(09)
[2]帕金森病的诊断[J]. 张振馨.  中华神经科杂志. 2006(06)
[3]常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征致病基因的突变分析[J]. 严新翔,张玉虎,郭纪锋,李静,夏昆,蔡芳,潘乾,龙志高,陈涛,曹立,沈璐,江泓,赵国华,唐北沙.  中华神经科杂志. 2005(06)
[4]常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征6型PINK1基因的突变分析[J]. 张玉虎,唐北沙,郭纪锋,夏昆,许波,蔡芳,邓汉湘,严新翔,陈涛,曹立,潘乾,龙志高.  中华医学杂志. 2005(22)



本文编号：3065891