促进轴突生长转录因子的筛选

发布时间：2017-04-14 23:15

  本文关键词：促进轴突生长转录因子的筛选，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经系统损伤后,受损的神经轴突不能有效再生,致使被破坏的神经环路无法有效重建,是阻碍神经系统损伤修复的最主要原因。目前对于损伤神经元的再生修复治疗策略主要集中于改善损伤区微环境,减少神经轴突再生的不利因素;神经干细胞的移植,新生的神经元替代失去的神经元,重建神经环路;以及提高神经元内源性再生能力等方法。其中,提高神经元内源性的再生能力,是有效促进神经系统损伤修复的基本方法之一。转录因子(Transcription Factor,TF)是一种DNA结合蛋白,能够与基因上特异性的位点结合从而直接或间接的调控基因的转录,在发挥基因生物功能中具有重要作用。本实验拟通过分子和细胞生物学方法筛选多种与轴突生长相关的转录因子,并试图将单个转录因子或者多个转录因子联合转染到类神经元细胞PC12和神经元当中,观察细胞突起生长情况,找出对促进细胞突起生长有效的单个转录因子或转录因子的组合。实验首先改造克隆及表达载体,获得pCAGSJ载体;其次,通过文献检索,确定38种转录因子为候选基因,利用RT-PCR及PCR的技术,获得转录因子的编码区序列(Coding DNA Sequence,CDS),并将其连接到经过改造的真核表达载体上,经过菌液PCR、酶切验证和测序后确定其序列连接的正确性;最后再通过脂质体转染的方法,将38种转录因子分别单独转染到PC12细胞中,检测细胞突起长度。结果发现:上述转录因子对细胞突起的生长均起到了一定的促进作用,但是每个转录因子促进突起生长的能力各有不同,其中CREB、KLF4、p50、STAT3、Hb9、Batf、Sox10、Sno N、Lmx1a和Lhx3等10种转录因子对细胞突起生长的促进作用最为明显,于是我们挑选上述10种转录因子作为我们后续筛选促轴突生长转录因子组合的候选基因。然而从上述10种转录因子中是否能筛选出某种组合,促进轴突生长,我们需要解决以下两个问题:1,筛选策略;2,是否存在组合一定比单个转录因子效果好。于是,我们挑选了CREB、p50、STAT3和KLF4四种转录因子,采用N-1的策略,即4个转录因子,每次只转3个,观察哪个转录因子对突起生长最为有效。我们采用以下转录因子组合:CREB+KLF4+p50、CREB+KLF4+STAT3、CREB+p50+STAT3、KLF4+p50+STAT3。结果发现缺少CREB和STAT3转录因子的组合中,细胞突起最短,说明CREB和STAT3对突起生长最为重要。随后验证CREB+STAT3组合效果,发现转染后,细胞突起最长。该研究结果初步验证我们的假设:即N-1策略可以用于转录因子组合的筛选;存在对轴突生长最为有效的转录因子组合。通过改变神经元基因表达水平的方式可以使神经元轴突的生长能力增强,不仅为研究神经损伤再生修复提供了理论基础,而且为临床治疗神经损伤性疾病提供了指导依据。
【关键词】：神经系统损伤 转录因子 细胞突起 内源性
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-31
• 第一部分 克隆及表达载体的构建31-41
• 1 实验材料31-34
• 1.1 主要试剂和缓冲液31-33
• 1.2 实验仪器、耗材33-34
• 2 实验方法34-36
• 2.1 克隆及表达载体的构建34-36
• 2.2 表达载体pCAGSJ-EGFP的构建及鉴定36
• 3 结果36-39
• 3.1 通过改造pCAGGS得到表达载体pCAGSJ36-39
• 3.2 表达载体pCAGSJ可以稳定高效的表达外源基因39
• 4 讨论39-41
• 第二部分 转录因子编码区序列的克隆及转录因子表达载体的构建41-57
• 1 实验材料41-46
• 1.1 实验动物41
• 1.2 主要试剂和缓冲液41-42
• 1.3 引物序列42-45
• 1.4 主要仪器、耗材45-46
• 2 实验方法46-52
• 2.1 总RNA的提取46-47
• 2.2 RNA的反转合成cDNA47
• 2.3 常规PCR扩增转录因子编码区序列47-48
• 2.4 转录因子编码区序列的回收48-51
• 2.5 转录因子编码区的测序51-52
• 3 结果52-55
• 3.1 提取各组织器官的RNA52
• 3.2 通过常规PCR扩增获得38种转录因子编码区序列52-55
• 3.3 得到38种转录因子的表达载体55
• 4 讨论55-57
• 第三部分 单个转录因子对PC12细胞突起生长作用的评估57-75
• 1 实验材料57-59
• 1.1 细胞系57
• 1.2 主要试剂和缓冲液57-58
• 1.3 实验仪器和耗材58-59
• 2 实验方法59-62
• 2.1 PC12细胞系的复苏、培养、传代和冻存59-60
• 2.2 无内毒素转录因子的提取60-61
• 2.3 转录因子转染到细胞61-62
• 2.4 对转录因子作用后不同时间点的细胞采集图像和定量分析62
• 3 结果62-73
• 3.1 多种转录因子可促进PC12细胞突起的生长62-73
• 3.2 筛选促进突起生长效果最为显著的10种转录因子作为后续工作的研究重点73
• 4 讨论73-75
• 第四部分 多种转录因子联合转染对PC12细胞突起生长作用的评估75-82
• 1 实验材料75-76
• 1.1 细胞系75
• 1.2 主要试剂和缓冲液75
• 1.3 实验仪器和耗材75-76
• 2 实验方法76-77
• 2.1 PC12细胞系的复苏、培养、传代和冻存76
• 2.2 转录因子的联合转染76
• 2.3 联合转染后细胞突起长度分析76-77
• 3 结果77-80
• 3.1 三种转录因子联合转染可以更好的促进PC12细胞突起的生长77-78
• 3.2 在CREB、Stat3、p50、Klf4四种转录因子中CREB+Stat3为“最优组合”，且N-1 策略在后期实验中可行78-80
• 4 讨论80-82
• 第五部分 慢病毒包装及感染原代神经元对其轴突生长作用的评估82-88
• 1 实验材料82-84
• 1.1 细胞系82
• 1.2 主要试剂和缓冲液82-83
• 1.3 实验仪器和耗材83
• 1.4 构建病毒载体所需引物83-84
• 1.5 慢病毒包装84
• 2 实验方法84-86
• 2.1 细胞的复苏、培养、传代和冻存84-85
• 2.2 慢病毒载体的构建85-86
• 3 结果86
• 4 讨论86-88
• 小结88-90
• 参考文献90-98
• 个人简历和研究成果98-99
• 致谢99

  本文关键词：促进轴突生长转录因子的筛选，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：307092