富马酸二甲酯对实验性自身免疫性神经炎治疗作用及机制的实验研究

发布时间：2017-04-15 01:18

  本文关键词：富马酸二甲酯对实验性自身免疫性神经炎治疗作用及机制的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的:吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是感染后发病的、免疫介导的外周神经和神经根的急性脱髓鞘疾病。是目前急性弛缓性瘫痪最常见病因,也是神经内科急症的主要病症。目前证实有效的治疗方法分别是血浆置换和静脉输注免疫球蛋白。但无论患者是否接受免疫治疗,仍有20%的病人遗留严重后遗症,5%的病人死亡。实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)是研究吉兰-巴雷综合征的经典的动物模型,有效模拟了吉兰-巴雷综合征的临床、组织病理和电生理特点,广泛用于探索吉兰-巴雷综合征的治疗方法。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是富马酸酯类的碳水化合物,具有多种生物活性,包括各种免疫调节和神经保护作用,已被美国食品药品管理局批准用于治疗复发-缓解型多发性硬化。但目前关于富马酸二甲酯在自身免疫性神经炎中的作用机制却尚不清楚。本项研究以EAN大鼠为研究对象,研究富马酸二甲酯对EAN的预防和治疗作用并探讨其作用机制。方法:乳化P0180-199肽段后,诱导Lewis大鼠成模。将造模后的大鼠随机分组,分为对照组,预防用药组和治疗用药组。采用双盲法观察并评分大鼠每天的临床症状。在疾病高峰期,即免疫后第16天,进行坐骨神经肌电图检测评估坐骨神经电生理受损情况,指标包括复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)波幅、潜伏期和运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity,MNCV)。在疾病高峰期,对大鼠坐骨神经进行取材,准备进行组织病理学检测评估炎症细胞浸润和脱髓鞘情况,并进行免疫荧光检测分析巨噬细胞分型情况;同时提取坐骨神经总蛋白,进行蛋白印迹分析,探讨富马酸二甲酯的作用通路。在疾病高峰期,对大鼠脾脏取材,提取单个核细胞,分析淋巴细胞增殖情况,应用聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测炎性细胞因子表达情况及应用流式细胞术检测巨噬细胞分型情况。体外培养哺乳动物永生化巨噬细胞株RAW264.7,诱导其分化为M1型巨噬细胞,并采用细胞免疫荧光法和聚合酶链式反应法探讨富马酸二甲酯对巨噬细胞分化的直接作用。采用曼-惠特尼u检验进行数据分析,比较对照组和用药组的差别。结果:富马酸二甲酯干预组可明显改善EAN的临床症状,并减轻外周神经受损程度。坐骨神经的组织病理学结果显示,富马酸二甲酯明显减轻了坐骨神经中炎症细胞的浸润及神经的脱髓鞘程度。进一步免疫荧光检测证实,富马酸二甲酯可以减少坐骨神经中浸润的促炎性M1型巨噬细胞的数目,同时却可以增加抗炎性M2型巨噬细胞的数目。这种现象在脾脏单个核细胞中也可以通过流式细胞术观察到,即在富马酸二甲酯干预组中单个核细胞中的M1型巨噬细胞比例较对照组是下降的,而M2巨噬细胞的比例则是升高的。将富马酸二甲酯直接作用于巨噬细胞系RAW264.7的体外实验也可以观察到巨噬细胞更少向M1分化而更多向M2型巨噬细胞分化的情况,说明巨噬细胞更多的向M2型分化的现象是与富马酸二甲酯的作用直接相关的。坐骨神经总蛋白的蛋白印迹分析及免疫荧光结果均表明抗氧化转录因子核因子红系衍生的相关因子2(Nrf2)和其下游产物血红素加氧酶1(HO-1)水平升高,表明富马酸二甲酯的对EAN的治疗作用及对巨噬细胞分化的影响与Nrf2-HO-1通路的激活有关。此外,脾脏单个核细胞的培养上清的酶联免疫吸附试验和单个核细胞的聚合酶链式反应结果显示富马酸二甲酯可以改善自身免疫性神经炎的外周炎症环境。结论:实验证明富马酸二甲酯可以有效改善EAN的临床症状及外周神经损伤程度。作用机制包括富马酸二甲酯促进外周巨噬细胞向M2型分化,这可能和抗氧化通路Nrf2-HO-1活性增强有关。此外,外周炎症环境的改善也和富马酸二甲酯的治疗作用有关。这些结果提示富马酸二甲酯是治疗多发性外周神经炎的重要候选药物。
【关键词】：实验性自身免疫性神经炎 巨噬细胞 富马酸二甲酯 吉兰-巴雷综合征 细胞因子
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 对象和方法16-33
• 1 材料16-20
• 1.1 实验动物16
• 1.2 实验试剂16-18
• 1.3 主要仪器设备及耗材18-19
• 1.4 主要试剂的配制19-20
• 2 实验方法20-33
• 2.1 EAN模型的制备、临床评分及给药20-21
• 2.2 神经电生理检测21
• 2.3 组织病理学检测21-23
• 2.4 免疫荧光检测23-24
• 2.5 流式细胞术24-25
• 2.6 蛋白质印迹分析25-28
• 2.7 实时聚合酶链式反应(RT-PCR)28-30
• 2.8 体外细胞实验30-31
• 2.9 淋巴增殖实验——MTS31
• 2.10 ELISA测细胞培养上清中细胞因子的水平31-32
• 2.11 统计学分析32-33
• 结果33-42
• 1. 富马酸二甲酯改善了EAN大鼠的症状33-34
• 2. 富马酸二甲酯减轻了外周神经中炎症细胞浸润和脱髓鞘的程度34
• 3. 富马酸二甲酯改善了EAN大鼠的外周神经损伤34-35
• 4. 富马酸二甲酯促进了EAN大鼠坐骨神经中巨噬细胞向M2型转变35-36
• 5. 富马酸二甲酯促进了EAN大鼠脾脏中巨噬细胞向M2型转变36-37
• 6. 富马酸二甲酯促进了体外试验中巨噬细胞RAW264. 7 向M2型分化37-38
• 7. 富马酸二甲酯促进了EAN大鼠坐骨神经中Nrf2和HO-1 的表达38-39
• 8. 富马酸二甲酯抑制淋巴细胞增殖39
• 9. 富马酸二甲酯改变了外周炎性细胞因子表达谱39-42
• 讨论42-47
• 1. 实验药物的选择42-43
• 2. 动物模型的特点43
• 3. 富马酸二甲酯对EAN的疗效评价43-44
• 4. 富马酸二甲酯对EAN中M1/M2巨噬细胞分化的影响和机制44-45
• 5. 富马酸二甲酯对EAN中的炎性环境变化的影响45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述 吉兰-巴雷综合征治疗进展54-65
• 综述参考文献61-65
• 致谢65-66
• 个人简历66

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本文编号：307285