山黧豆神经性中毒的细胞信号途径及分子机理研究

发布时间：2017-04-23 19:02

  本文关键词：山黧豆神经性中毒的细胞信号途径及分子机理研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：山黧豆(Lathyrus sativas L.)是优良的旱地作物种质资源,长期过量食用会导致人畜神经性山黧豆中毒(Neurolathyrism)。神经性山黧豆中毒是一种由β-ODAP引起的人畜神经退行性疾病,但其细胞及分子机理尚不明确。本研究采用离体培养的人神经胶质瘤细胞系M059K作为实验体系,以谷氨酸为对照,采用从山黧豆种子提取纯的β-ODAP,使用浓度梯度的药物处理细胞,通过分析细胞存活力与生长动态确定加药浓度,利用流式细胞术、共聚焦显微术、免疫细胞化学和转录组测序等相关技术追踪检测β-ODAP对细胞增殖力、细胞形态与细胞周期的变化、细胞死亡方式与DNA损伤、线粒体膜电位与细胞骨架、钙稳态调节状况和基因差异表达的动态方面对细胞的影响的。最终通过经典数理统计、显微实证和分子表达路径分析方法,主要得出如下结果：1.通过MTT实验,用2-22 mM共10个浓度梯度β-ODAP及Glu处理细胞后测得的OD值,绘制细胞抑制曲线,计算得到半抑制浓度IC50=17.70 mM,为了更好地模拟体外中毒的过程,避免Glu对细胞产生毒性作用干扰研究,确定将10mM药物浓度作为本研究的相关实验的施加剂量,此时β-ODAP造成的细胞抑制率为24.6%,Glu为0.2%。2.毒素β-ODAP处理细胞,使用FITC标记的Annexin V作为探针利用流式细胞术检测后发现,细胞并未出现显著的凋亡现象,不同药物处理时间下凋亡细胞比例均低于2%；进一步通过流式细胞术检测,未发现细胞周期阻滞现象；免疫组化实验检测DNA断裂状况,未发现明显的DNA损伤；进一步通过流式细胞术检测,未发现细胞周期阻滞现象；免疫组化实验检测DNA断裂状况,未发现明显的DNA损伤,细胞克隆形成实验结果显示,β-ODAP可抑制细胞增殖,显著降低克隆形成;3.毒素β-ODAP处理细胞后,使用Fluo 3-AM及Mito-Tracker M7512分别标记细胞内钙离子和线粒体,利用免疫组化实验观测二者变化。结果发现,β-ODAP处理6h后便可使细胞内钙离子持续增多并被线粒体吸收,这种现象随处理时间延长而加剧,处理24 h后部分细胞中线粒体失活。而Glu处理后钙离子增加速度低于β-ODAP组；使用Rho 123作为指示剂,流式细胞术检测线粒体膜电位也观测到β-ODAP引起的持续性膜电位下降。4.毒素β-ODAP处理显著性地破坏细胞骨架。毒素处理细胞后,使用鬼笔环肽标记细胞骨架,观测结果显示β-ODAP可影响细胞骨架严重变形坍塌,绿色荧光强度明显减弱,F-actin聚合体发生翻转和折叠,与细胞核分离,微丝的胞间连接出现断裂。5.基因检测和表达结果分析表明,毒素β-ODAP处理细胞24 h后,通过转录组测序及实时定量PCR技术测定细胞转录组变化情况,结果发现β-ODAP会引起细胞外基质和黏着斑等通路上的Integrinβ1、Laminin、Fibronectin、Paxillin等16条基因差别表达,同时引起多种其他神经退行性疾病通路中的关键致病基因上调。6.勾画了毒素中毒的细胞信号途径和初步揭示了其分子机理。上述研究结果表明,β-ODAP造成的细胞凋亡和坏死并不是其损伤神经元的主要方式,毒素β-ODAP可以结合并异常激活神经细胞的AMPA受体,使得β1整合蛋细胞表面表达量上升,进一步使黏着斑激酶磷酸化增加,FA蛋白单元在细胞微丝上大量聚集,诱使桩蛋白的表达量上调,影响细胞骨架聚合,最终引起神经细胞营养障碍。此外,大量内流的Ca2+导致细胞内稳态失调,细胞生存力和增值率迅速下降,线粒体摄取过多的Ca2+引起线粒体膜电位改变,使ATP合成受阻,ROS生成增加,进而对生物膜造成损伤,也会导致细胞损伤而死亡。上述研究结果表明,β-ODAP造成的细胞凋亡和坏死并不是其损伤神经元的主要方式,毒素β-ODAP可以结合并异常激活神经细胞的AMPA受体,导致Ca2+产生细胞内流,使得p1整合蛋细胞表面表达量上升,进一步使黏着斑激酶磷酸化增加,黏着斑蛋白单元在细胞微丝上大量聚集,诱使桩蛋白的表达量上调,影响细胞骨架聚合,最终引起神经细胞营养障碍。此外,大量内流的Ca2+导致细胞内稳态失调,细胞生存力和增值率迅速下降,线粒体摄取过多的Ca2+引起线粒体膜电位改变,使ATP合成受阻,ROS生成增加,进而对生物膜造成损伤,也会导致细胞损伤而死亡。综上所述,山黧豆神经性中毒的信号途径非常复杂,涉及不同层次和不同途径的多基因调控。本研究首次采用神经胶质瘤细胞体外模拟的方式,对山黧豆神经性中毒的细胞信号途径和分子机理进行初步探索,初步勾画了山黧豆中毒的细胞信号通道、基因差异表达和调控途径,为将来防控和治愈山黧豆中毒提供理论参照。但限于作者的研究周期只有两年,研究手段尚存在不足,暂未对β-ODAP分子进行标记和定位,相关研究有待将来进一步完善。
【关键词】：L-β-N-草酰-α β-二氨基丙酸 神经性山黧豆中毒 神经退行性疾病 钙稳态失调 氧化胁迫 基因表达概况分析 细胞骨架 线粒体膜电位 细胞外基质与受体作用
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741;R595
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-21
• 1.1 山黧豆作为重要种质资源在全球变化和粮食安全中的作用12
• 1.2 山黧豆中毒发生的历史背景12-14
• 1.3 山黧豆中毒机理的研究进展14-20
• 1.3.1 β-ODAP引起神经性中毒的动物实验14-15
• 1.3.2 影响神经递质谷氨酸正常功能15-16
• 1.3.3 破坏神经元细胞内钙稳态16-17
• 1.3.4 加剧氧化胁迫破坏线粒体功能17-19
• 1.3.5 神经性山黧豆中毒与神经退行性疾病19-20
• 1.4 神经性山黧豆中毒机理研究的不足20-21
• 第二章 立项依据及研究内容21-24
• 2.1 立项依据21-22
• 2.2 研究内容及流程图22-23
• 2.3 主要仪器及药品耗材23-24
• 2.3.1 主要仪器简介23
• 2.3.2 主要耗材23-24
• 第三章 毒素β-ODAP对细胞生存率、细胞周期及死亡动态的影响24-38
• 3.1 材料与方法24-30
• 3.1.1 材料24-25
• 3.1.2 方法25-30
• 3.2 结果30-37
• 3.2.1 细胞生存力的变化30-31
• 3.2.2 细胞形态的变化31
• 3.2.3 细胞克隆形成率的变化31-32
• 3.2.4 细胞死亡动态32-35
• 3.2.5 细胞周期的变化35-36
• 3.2.6 DNA损伤的状况36-37
• 3.3 讨论37-38
• 第四章 毒素β-ODAP对细胞结构及功能的影响38-49
• 4.1 材料与方法38-40
• 4.1.1 材料38-39
• 4.1.2 方法39-40
• 4.2 结果40-46
• 4.2.2 细胞内钙离子浓度的变化40-43
• 4.2.2 线粒体膜电位的变化43-44
• 4.2.3 细胞骨架损伤的状况44-46
• 4.3 讨论46-49
• 4.3.1 β-ODAP与Ca~(2+)稳态失调46
• 4.3.2 β-ODAP与氧化损伤46-47
• 4.3.3 β-ODAP与细胞骨架解体47-49
• 第五章 毒素β-ODAP对细胞基因表达状况的影响49-65
• 5.1 材料与方法49-53
• 5.1.1 材料49-51
• 5.1.2 方法51-53
• 5.2 结果53-62
• 5.2.1 M059K细胞系的表达谱分析53-60
• 5.2.2 qRT-PCR对测序结果的验证60-62
• 5.3 讨论62-65
• 5.3.1 β-ODAP与基因差别表达活性62-65
• 第六章 经性山黧豆中毒症与其他神经退行性疾病关系的探讨65-69
• 6.1 不同神经退行性疾病之间的异同点65-66
• 6.2 不同神经退行性疾病之间的关系66
• 6.3 神经退行性疾病神经元死亡主要方式的探讨66-69
• 第七章 主要结论及展望69-72
• 7.1 β-ODAP触发神经元损伤的机理69-71
• 7.2 神经退行性疾病神经元死亡的主要方式71-72
• 参考文献72-78
• 在学期间的研究成果78-79
• 基金项目资助79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张晓晖,姚天明,黄高f,王文亮;细胞凋亡的最新研究进展[J];第四军医大学学报;2002年S1期

2 刘绪川;张国伟;李雅茹;王菊香;梁兆年;史灯;郑玉莲;;山黧豆有毒成分(BOAA)小鼠急性中毒试验[J];中兽医医药杂志;1987年01期

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本文编号：322842