人胶质瘤细胞的干细胞特性及诱导分化研究

发布时间：2017-04-25 01:28

  本文关键词：人胶质瘤细胞的干细胞特性及诱导分化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过对人胶质瘤细胞株U251的干细胞特性和多向分化潜能的相关研究,揭示胶质瘤细胞的细胞生物学特性;进一步研究胶质瘤细胞向脂肪细胞及成骨细胞分化的条件及可能的机制;进一步展望诱导分化方法作为一种新颖的脑胶质瘤治疗方法的临床应用前景。方法:常规传代培养胶质瘤细胞株U251,并将U251细胞传代培养于24孔细胞培养板中,恒温CO2细胞培养箱培养。待细胞贴壁后,用4%多聚甲醛固定U251细胞,并检测U251中干细胞标志物Sall4、NCAM、Oct4、Sox2、Nestin、和S100β表达情况,荧光显微镜下观察U251细胞上述标志物的表达情况。将贴壁生长的U251细胞分别经成脂肪细胞诱导培养基(含有2μmol/L胰岛素、500μmol/L(IBMX)、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛)和成骨细胞诱导培养基(含有100mmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠及0.05mmol/L维生素C)诱导分化后,分别用油红O染色方法检测细胞中脂滴形成情况,茜素红染色检测细胞中钙结节形成情况。CCK8法检测经诱导分化后U251细胞生长曲线。免疫蛋白印迹法分别测定脂肪细胞和成骨特异性蛋白表达以及诱导分化过程中细胞自噬和凋亡蛋白表达情况。结果:1.多种干细胞标志物均在人胶质瘤细胞株U251中稳定表达。免疫荧光结果显示在U251中神经细胞黏附分子NCAM、神经嵴干细胞标记物Nestin、神经胶质细胞标记物S100β,多能干细胞标记物Sall4、Oct4及神经干细胞的标记物Sox2均能够稳定表达。2.U251细胞经诱导后可以向脂肪细胞分化。在贴壁生长的胶质瘤细胞中加入成脂细胞诱导分化培养基后,经过诱导不同的时间梯度,油红O染色发现胶质瘤细胞中出现脂滴,并且随着诱导的时间越长,脂滴数量增多并融合增大,且细胞增殖速度减慢,这点由CCK8实验结果得以证实。通过免疫蛋白印迹实验结果发现经诱导培养基诱导后的胶质瘤细胞中脂肪细胞相关特异性蛋白表达增加。3.U251细胞经诱导可以向成骨细胞分化。在贴壁生长的胶质瘤细胞中加入成骨细胞诱导分化培养基后,经过诱导不同的时间梯度,茜素红染色发现胶质瘤细胞中出现大量钙结节,并且随着诱导时间的延长,钙结节增多。CCK8实验结果显示经诱导分化后肿瘤细胞增殖减慢;免疫蛋白印迹实验结果显示成骨细胞相关特异性蛋白表达增多,并且随着诱导时间的延长细胞凋亡、自噬及增殖相关蛋白表达也增加。结论:1.人胶质瘤细胞U251具有干细胞特性和多向诱导分化潜能,在一定条件能够被诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。2.诱导分化剂能够抑制细胞增殖,并能够促进U251细胞发生终末分化并出现细胞自噬和凋亡现象。3.诱导分化方法能够作为人胶质瘤是一种潜在的、有效的新型治疗方法。
【关键词】：脑胶质瘤 诱导分化 干细胞特性 细胞凋亡 自噬
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 中英文对照表9-13
• 第一章 绪论13-17
• 1.1 胶质瘤13
• 1.2 肿瘤干细胞13-14
• 1.3 诱导分化治疗14-15
• 1.4 研究的内容、方法、目的、意义及技术路线15-17
• 第二章 人胶质瘤细胞的体外培养及干细胞特性鉴定17-23
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 细胞株：人胶质瘤U251细胞购于上海细胞库，，由本实验室保存于液氮。17
• 2.1.2 主要试剂和试剂盒：17
• 2.1.3 主要实验设备及耗材：17-18
• 2.1.4 主要试剂的配制18-19
• 2.2 试验方法19-20
• 2.2.1 细胞培养19-20
• 2.2.2 免疫荧光鉴定胶质瘤细胞的干细胞特性20
• 2.3 实验结果20-21
• 2.4 讨论21-23
• 第三章 体外诱导人胶质瘤细胞向脂肪细胞分化23-35
• 3.1 实验材料23-26
• 3.1.1 细胞株23
• 3.1.2 主要试剂和试剂盒23-24
• 3.1.3 主要实验设备及器材24
• 3.1.4 主要试剂的配制24-26
• 3.2 试验方法26-30
• 3.2.1 U251细胞向脂肪细胞诱导分化26
• 3.2.2 油红O染色26-27
• 3.2.3 免疫蛋白印迹法测定脂肪细胞相关蛋白表达27-29
• 3.2.4 CCK8法绘制细胞生长曲线测定29-30
• 3.2.5 统计学分析30
• 3.3 实验结果30-33
• 3.3.1 油红O染色结果30-31
• 3.3.2 免疫印迹结果及统计分析31-33
• 3.3.3 经成脂诱导分化后U251细胞生长曲线33
• 3.4 讨论33-35
• 第四章 体外诱导人胶质瘤细胞向成骨细胞分化35-42
• 4.1 实验材料35-36
• 4.1.1 细胞株35
• 4.1.2 主要试剂和试剂盒35-36
• 4.1.3 主要实验设备和耗材36
• 4.1.4 主要试剂的配制36
• 4.2 试验方法36-37
• 4.2.1 U251细胞的向成骨细胞诱导分化36
• 4.2.2 茜素红染色36-37
• 4.2.3 免疫蛋白印迹法检测成骨细胞相关特异性蛋白表达37
• 4.2.4 CCK8实验检测细胞生长曲线测定37
• 4.2.5 统计学分析37
• 4.3 实验结果37-40
• 4.3.1 茜素红染色结果37-38
• 4.3.2 免疫印迹结果及统计分析38-39
• 4.3.3 经成骨诱导分化后U251细胞生长曲线39-40
• 4.4 讨论40-42
• 实验总结及展望42-43
• 1.实验总结42
• 2.展望42-43
• 参考文献43-49
• 综述49-62
• 参考文献55-62
• 攻读硕士学位期间发表的文章62-63
• 致谢63

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