miR-218对胶质瘤抑瘤作用及其机制的研究

发布时间：2021-07-05 18:59

　　[目的]microRNA-218（miR-218）是一种重要的抑瘤微小RNA（miRNA）,其表达异常可见于多种实体肿瘤及癌前病变。本室前期研究发现胶质瘤miR-218表达水平随其良恶性程度升高而相应降低,提示其表达减少或缺失可能在胶质瘤发生、发展中起到重要作用。生物信息学预测显示细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）是miR-218的潜在靶基因,且胶质瘤CDK6表达水平随其良恶性程度升高而相应增加,但在胶质瘤细胞中二者表达变化的确切关系如何,尚待进一步证实。本研究旨在观察miR-218在恶性胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及诱导细胞成熟分化方面的作用,证实CDK6是否miR-218的天然靶基因,探讨miR-218特异性敲低CDK6表达是否是该miRNA发挥抑瘤作用的分子机制。[方法]①通过质粒转染和G418筛选建立过表达miR-218的U87MG和SNB-19亚细胞系及对照亚细胞系,采用stem-loop qRT-PCR比较各亚细胞系中miR-218的表达水平。②采用荧光素酶实验、qRT-PCR及Western blot验证CDK6是否是miR-218的天然靶基因,探讨miR-218敲... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
材料与方法
    1. 主要实验仪器
    2. 实验材料
        2.1 细胞系
        2.2 引物、DNA合成序列及重组质粒
        2.3 主要试剂
    3. 实验方法
        3.1 细胞转染和亚细胞系的筛选
            3.1.1 细胞培养
            3.1.2 转染质粒的准备
            3.1.3 细胞转染
            3.1.4 稳定亚细胞系的筛选
        3.2 各亚细胞系miR-218表达水平的检测
            3.2.1 总RNA的提取
            3.2.2 miR-218表达水平的qRT-PCR检测
        3.3 荧光素酶实验
            3.3.1 重组荧光素酶表达质粒的构建
            3.3.2 细胞分组及质粒转染
            3.3.3 荧光素酶活性检测
        3.4 Western blot检测
            3.4.1 分组及细胞总蛋白的提取
            3.4.2 SDS-PAGE
            3.4.3 免疫印渍
        3.5 CDK6 mRNA的qRT-PCR检测
            3.5.1 分组及总RNA样品
            3.5.2 检测过程
        3.6 免疫细胞化学检测
            3.6.1 分组及细胞铺片的制备
            3.6.2 免疫细胞化学染色
            3.6.3 结果判读
        3.7 细胞周期检测
        3.8 体外克隆形成实验
        3.9 凋亡检测
            3.9.1 Caspase 3/7生物活性检测
            3.9.2 FCM凋亡检测
        3.10 迁移侵袭实验
            3.10.1 体外迁移侵袭实验
            3.10.2 定量侵袭实验
        3.11 Matrigel 3D培养
        3.12 免疫荧光检测
        3.13 统计学方法
结果
    1. 稳定过表达miR-218及无义对照序列的亚细胞系的建立
    2. miR-218可在恶性胶质瘤细胞中直接抑制CDK6的表达
        2.1 重组荧光素酶报导基因表达质粒的构建
        2.2 荧光素酶实验结果
        2.3 miR-218可在恶性胶质瘤细胞中抑制CDK6的表达
    3. miR-218可有效抑制胶质母细胞瘤细胞系的增殖
        3.1 各胶质母细胞瘤亚细胞系细胞增殖活性的比较
        3.2 miR-218可显著降低SNB-19细胞系的克隆形成效率
        3.3 miR-218可诱导胶质母细胞瘤细胞系的G_1期阻滞
    4. miR-218可诱导胶质母细胞瘤细胞系的凋亡
        4.1 各胶质母细胞瘤亚细胞系Caspase 3/7生物活性的比较
        4.2 miR-218可明显提高U87MG及SNB-19细胞的凋亡指数
    5. miR-218可抑制恶性胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力
        5.1 各胶质母细胞瘤亚细胞系迁移和侵袭能力的比较
        5.2 miR-218对U87MG及SNB-19细胞侵袭能力影响的定量检测结果
        5.3 各胶质母细胞瘤亚细胞系Matrigel 3D培养结果
    6. miR-218可促进恶性胶质瘤细胞的成熟分化
        6.1 各胶质母细胞瘤亚细胞系CD133及Nestin表达水平的比较
        6.2 各胶质母细胞瘤亚细胞系GFAP LI的比较
        6.3 CD133及Nestin表达的免疫荧光检测结果
讨论
    1. miR-218可通过诱导G_1期阻滞有效抑制恶性胶质瘤细胞的增殖
    2. miR-218可阻断CDK6的表达
    3. miR-218可诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡
    4. miR-218可通过阻断CDK6表达抑制恶性胶质瘤细胞的迁移侵袭
    5. miR-218可通过阻断CDK6表达诱导恶性胶质瘤细胞的成熟分化
    6. 结束语
结论
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述
    综述参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]胶质瘤miR-218与细胞周期蛋白依赖性激酶6表达的相互关系及其对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响[J]. 张景敏,孙翠云,于士柱,王虔,安同岭,李艳艳,孔妍玲,温艳军.  中华病理学杂志. 2011 (07)



本文编号：3266640