过表达Nurr1基因的小胶质细胞对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

发布时间：2017-04-26 02:07

  本文关键词：过表达Nurr1基因的小胶质细胞对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探讨Nurr1基因对小胶质细胞活化状态的影响及过表达Nurr1基因的小胶质细胞对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响,并初步探讨其可能相关的作用机制,为帕金森病的神经干细胞移植治疗提供新的思路和方法,使治疗效果得到改善。方法：1.解剖分离新生(0～2d)SD大鼠大脑皮质,经胰酶消化及机械吹打制成单细胞悬液,接种于含有10%胎牛血清的培养基中培养,7-10 d后,经机械振摇和差速贴壁法,纯化小胶质细胞,并进行CD11b/c免疫细胞化学鉴定。2.将全基因合成的大鼠Nurr1基因编码序列克隆至真核表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV构建重组质粒pCDH-Nurr1,并进行酶切鉴定及序列分析。再以脂质体转染试剂介导重组质粒pCDH-Nurr1转染小胶质细胞。3.向过表达Nurr1基因的小胶质细胞和单纯小胶质细胞中加入LPS以激活,并设阴性对照组,相同时间点收集各组细胞培养液,用ELISA法检测不同状态下小胶质细胞分泌炎症相关因子和神经营养因子的差异以Nurr1基因对不同状态下小胶质细胞分泌上述各种因子的影响。4.解剖分离孕14d的SD大鼠胚胎腹侧中脑组织,经机械吹打制成单细胞悬液,接种于NSCs完全培养基中,观察其生长、分化并进行Nestin免疫细胞化学鉴定以及诱导分化后(接种于NSCs分化培养基中)的β-3-tubulin、GFAP、TH免疫细胞化学鉴定。5.采用Transwell系统,下层培养小胶质细胞,上层培养NSCs,并分组如下：(1)单纯小胶质细胞与NSCs共培养；(2)过表达Nurr1基因的小胶质细胞与NSCs共培养。在共培养3d、6d、9d时,观察两组NSCs的存活、生长,以及向DA能神经元分化的情况。6.上述时间点分别采用免疫细胞化学法检测两组NSCs向DA能神经元的分化情况；Western Blot检测两组NSCs向DA能神经元分化的相关蛋白(DAT、 TH、FOXA2、Otx2、Pitx3、VMAT2、Lmx1a)表达水平情况；实时荧光定量PCR检测两组NSCs向DA能神经元分化成熟相关基因(DAT、TH、FOXA2、 Otx2、Pitx3、VMAT2、Lmxla)的表达情况。结果：1.混合胶质细胞培养至7-10 d时,细胞呈充分分层生长,经机械振摇和差速贴壁的方法获得纯化小胶质细胞,经特异性标志物CD11b/c免疫细胞化学鉴定为阳性,纯度在95%。2.本实验成功构建了Nurr1基因真核表达质粒载体pCDH-Nurr1,经酶切鉴定和序列分析,判定为阳性克隆。3. ELISA法检测结果示过表达Nurr1基因的小胶质细胞较单纯小胶质细胞能显著减少LPS所致炎症相关因子TNF-α、IL-1的分泌,并可促使BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的分泌。4.大鼠胚胎NSCs原代培养7d后,可形成大量呈悬浮生长巢蛋白(Nestin)免疫阳性的神经球(neurosphere),经诱导分化培养后细胞呈β-3-tubulin、GFAP或TH免疫阳性。5.在共培养3d、6d、9d时,两组NSCs分化后经免疫细胞化学检测,结果显示过表达Nurr1基因的小胶质细胞与NSCs共培养组较单纯小胶质细胞与NSCs共培养组可使更多的NSCs向DA能神经元分化。6.上述时间点,Western blot结果显示过表达Nurr1基因的小胶质细胞与NSCs共培养组的NSCs向DA能神经元分化相关蛋白(DAT、TH、FOXA2、Otx2、 Pitx3、VMAT2、Lmx1a)的相对表达量在多数时间点时较单纯小胶质细胞与NSCs共培养组增多。7.上述时间点,实时荧光PCR结果显示,过表达 Nurr1基因的小胶质细胞与NSCs共培养组的NSCs向DA能神经元分化成熟相关基因(DAT、TH、FOXA2、 Otx2、Pitx3、VMAT2、Lmx1a)的表达情况优于单纯小胶质细胞与NSCs共培养组。结论：Nurr1基因不仅可抑制小胶质细胞的活化和炎症相关因子的产生,而且可促进GDNF、BDNF、DNF等与DA能神经元存活和成熟等相关的神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的小胶质细胞与神经干细胞共培养对神经干细胞分化为DA能神经元具有促进作用。Nurr1基因有望成为细胞移植治疗PD的重要、潜在调控靶点之一
【关键词】：Nurr1基因 过表达 小胶质细胞 神经干细胞
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 符号说明11-13
• 引言13-16
• 材料与试剂16-22
• 第一部分 Nurr1基因对小胶质细胞活化状态的影响22-36
• 一 材料和方法22-29
• 二 结果29-34
• 三 讨论34-36
• 第二部分 过表达Nurr1基因的小胶质细胞对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响36-62
• 一 材料和方法36-42
• 二 结果42-58
• 三 讨论58-62
• 结论62-63
• 参考文献63-68
• 综述68-77
• 参考文献74-77
• 论文发表情况77-78
• 致谢78

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本文编号：327512