红色荧光人脑胶质瘤干细胞的建立及其生物学特性观察

发布时间：2021-07-20 05:36

　　目的建立体外稳定表达红色荧光蛋白（RFP）的人脑胶质瘤干细胞。方法用带有红色荧光蛋白基因的慢病毒转染人脑胶质瘤干细胞，荧光显微镜下观察RFP阳性细胞表达情况。流式细胞仪分选红色荧光表达的胶质瘤干细胞，完成克隆筛选后的人脑胶质瘤干细胞在体外连续传代培养20代，再次经流式细胞仪测定其转染率；MTT法比较转染前后干细胞的生长曲线变化；通过PCR扩增检测红色荧光（RFP）基因整合到干细胞基因组。然后对转染后的干细胞进行生物学特性分析：细胞免疫组化鉴定转染后干细胞表面标志物CD133、Nestin的表达情况；由于肿瘤干细胞具有多向分化潜能，故在含胎牛血清培养基培养10天诱导其向胶质细胞和神经元细胞分化，细胞免疫组化分析分化后GFAP,S100（胶质细胞样细胞标志物）表达；在血管内皮细胞转化培养基培养10天诱导其向血管内皮细胞分化，并在Matrigel胶中3D培养，在显微镜和荧光显微镜下观察诱导后细胞立体形态，细胞免疫组化分析内皮细胞表面标志物CD31表达；收集红色荧光蛋白表达干细胞移植到绿色荧光裸鼠皮下，成瘤后取出肿瘤，行超薄冰冻切片、HE染色，在荧光显微镜下观察转染后干细胞在绿色荧光裸鼠体内生... 

【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

SU2培养第七天倒置显微镜下见细胞呈球状悬浮生长,部分细胞贴壁生长

2.2 .慢病毒未转染前干细胞球的鉴定SU2形成干细胞球后，行CD133,Nestin细胞免疫荧光染色，结果显示克隆球中大部分细胞膜胞浆发出红色荧光（表明其表达CD133,见图2A）或者绿色荧光（表明其表达Nestin,见图2B）;而内皮细胞标记物CD31及KDR的免疫荧光染色均呈阴性（图片未给出）。图2 脑胶质瘤干细胞呈干细胞球样生长:(A) 脑胶质瘤干细胞免疫荧光染色CD133呈阳性（×100倍）； (B) Nestin免疫荧光染色阳性，其中可见干细胞球（×100倍）2.3. 红色荧光慢病毒转染SU2,体外连续培养20代后在荧光显微镜下观察，RFP仍呈高表达见图2。图2. 转染RFP人脑胶质瘤干细胞(RFP-SU2)呈悬浮球状生长，荧光显微镜可见细胞发红色荧光（A×200 B×100）2.4．流式细胞仪(FCM)检测结果慢病毒转染胶质瘤干细胞（SU2）后，经FACS筛选RFP阳性表达细胞，在体外连续培养20代，再次经FCM检测其转染率达75%以上（见图3B），考虑到部分细胞红色AB

2.3. 红色荧光慢病毒转染SU2,体外连续培养20代后在荧光显微镜下观察，RFP仍呈高表达见图2。图2. 转染RFP人脑胶质瘤干细胞(RFP-SU2)呈悬浮球状生长，荧光显微镜可见细胞发红色荧光（A×200 B×100）2.4．流式细胞仪(FCM)检测结果慢病毒转染胶质瘤干细胞（SU2）后，经FACS筛选RFP阳性表达细胞，在体外连续培养20代，再次经FCM检测其转染率达75%以上（见图3B），考虑到部分细胞红色AB

【参考文献】：
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本文编号：3292241