异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及机制研究
发布时间：2017-05-01 15:10
本文关键词：异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:本研究探讨了不同浓度异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及机制,旨在为异甘草素在治疗人脑胶质瘤的应用提供一定的实验依据。方法:(1)采用无血清培养基(含EGF、FGF、B27)以培养皿、培养瓶及Cyagen6孔悬浮细胞培养板为载体培养SHG44人脑胶质瘤干细胞,通过CD133、Nestin联合Bcl-2标记进行免疫荧光鉴定,并对比其倒置显微镜下细胞形态及干细胞球的形态、大小及数目,通过扫描电镜观察干细胞形态。(2)经对比研究后,采用Cyagen 6孔悬浮细胞培养板为载体提取、纯化和培养SHG44人脑胶质瘤干细胞,以无血清DMEM/F12培养基(含EGF、FGF、B27)(含与实验组等量的DMSO)为对照组,异甘草素(5~160μmol/L)为实验组,通过CCK-8法检测作用12 h、24 h、48 h及72 h后的细胞活性,并观察药物作用至第7 d胶质瘤干细胞球的形成情况。(3)通过浓度和时间筛选后,以无血清DMEM/F12培养基(含EGF、FGF、B27)(含与实验组等量的DMSO)为对照组,异甘草素(10~160μmol/L)为诱导组,DAPT(2.0μmol/L)为阻断剂组,异甘草素+阻断剂组(10~160μmol/L+2.0μmol/L DAPT),通过免疫荧光染色观察异甘草素作用24~72 h后细胞表面分化标志物神经胶质酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)及干细胞标志物巢蛋白(Nestin)表达情况,通过Western blot检测异甘草素作用72 h后Nestin、GFAP及β-TubulinⅢ的表达情况,通过流式细胞术检测异甘草素作用72 h后的细胞周期,通过Real-time PCR检测作用72 h后Notch1、RBP-JK及Hes1的表达。结果:(1)SHG44胶质瘤干细胞在无血清培养基中呈悬浮克隆球样生长,免疫荧光染色鉴定干细胞标记物CD133、Nestin表达呈阳性,且癌基因Bcl-2表达呈阳性;Cyagen 6孔悬浮培养板培养纯化的胶质瘤干细胞球较培养皿和培养瓶纯化的胶质瘤干细胞球大且数目多(P0.05);对于Cyagen 6孔悬浮培养板,随着纯化次数增加,胶质瘤干细胞球更大、数目更多(P0.05),且呈更规则球形;倒置显微镜下胶质瘤干细胞呈类圆形,扫描电镜下呈球形,可见较长梭形突起和较多细小突起,细胞间以触角沟通。(2)异甘草素在12-48h,随着浓度增加细胞增殖活性增强,且p0.05,72h后随着浓度增加细胞增殖活性显著降低,且p0.05;隔日加药至第7d时,经统计分析胶质瘤干细胞球数目减少、直径减小(与对照组比),且p0.05,当异甘草素浓度小于40μmol/l时,与160μmol/l相比,干细胞数目、直径均具有统计学意义(p0.05),当异甘草素浓度大于40μmol/l时,与160μmol/l相比,干细胞数目、直径均无统计学意义(p0.05)。(3)对照组胶质瘤干细胞无明显分化,异甘草素组在24~48h,随浓度增加分化细胞越多,且干细胞随之减少,在72h后,随着浓度增加分化细胞及干细胞同时减少。westernblot实验结果显示:异甘草素作用72h后:与对照组比较,随着异甘草素浓度的增加nestin蛋白表达量逐渐下调,差异具有统计学意义(p0.05);与对照组比较,10、40、160μmol/l组gfap蛋白表达水平均上调,差异具有统计学意义(p0.05),且40μmol/l组gfap蛋白表达量较其他浓度组均较高,差异具有统计学意义(p0.05);与对照组比较,10、40、160μmol/l组β-tubulinⅢ蛋白表达水平均上调,差异具有统计学意义(p0.05),且10μmol/l组β-tubulinⅢ蛋白表达量较其他浓度组均较高,差异具有统计学意义(p0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果:异甘草素作用72h后,与对照组相比,随着异甘草素浓度的增加g0/g1期细胞比例显著增加,差异具有统计学意义(p0.05)。real-timepcr检测结果:notch1通路阻断剂作用后,与对照组比较,各异甘草素组和阻断剂组notch1、rbp-jk及hes1基因表达均显著下调,差异具有统计学意义(p0.05);与异甘草素组比较,notch1、rbp-jk及hes1基因表达在异甘草素加dapt组及阻断剂组显著下调,差异具有统计学意义(p0.05);与阻断剂组比较,notch1、rbp-jk及hes1基因表达在异甘草素加dapt组显著下调,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:(1)cyagen6孔悬浮细胞培养板是培养胶质瘤干细胞较理想的载体。(2)异甘草素能诱导shg44人脑胶质瘤干细胞向星形胶质细胞和神经元细胞分化,且能抑制胶质瘤干细胞的增殖。(3)异甘草素诱导SHG44胶质瘤干细胞向星形细胞和神经元细胞的分化可能与下调Notch1信号通路中的Notch1、RBP-JK及Hes1有关。
【关键词】：异甘草素 SHG44胶质瘤干细胞 Notch1信号通路 分化作用 抑制作用
【学位授予单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：
- 摘要6-9
- ABSTRACT9-12
- 中英文缩略词表12-13
- 前言13-15
- 实验研究15
- 实验一 不同无血清培养基载体提取SHG44人脑胶质瘤干细胞的比较研究15-24
- 1 材料与方法15-16
- 1.1 实验材料15
- 1.2 主要实验仪器15
- 1.3 主要实验试剂15-16
- 2 试验方法16-17
- 2.1 无血清DMEM/F12(1:1)培养基配制16
- 2.2 人脑胶质瘤SHG44细胞在含血清培养基中常规培养16
- 2.3 采用不同无血清载体悬浮培养人脑胶质瘤SHG44干细胞16-17
- 2.4 免疫荧光染色鉴定胶质瘤干细胞球17
- 2.5 扫描电镜观察胶质瘤干细胞形态17
- 2.6 统计分析17
- 3 实验结果17-21
- 3.1 人脑胶质瘤SHG44干细胞在不同无血清载体中的悬浮培养17-19
- 3.2 胶质瘤干细胞标记物鉴定19-21
- 3.3 扫描电镜下胶质瘤干细胞的形态21
- 4 讨论21-24
- 实验二 应用体外培养SHG44胶质瘤干细胞筛选异甘草素抑制其增殖的最佳参数24-32
- 1 材料与方法24-25
- 1.1 实验材料24
- 1.2 主要实验仪器24
- 1.3 主要实验试剂24-25
- 2 实验方法25-26
- 2.1 SHG44人脑胶质瘤细胞的培养25
- 2.2 SHG44人脑胶质瘤干细胞培养及鉴定25-26
- 2.3 实验分组26
- 2.4 CCK-8 法检测细胞活性26
- 2.5 异甘草素作用下SHG44人脑胶质瘤干细胞形态观察26
- 2.6 统计学分析26
- 3 实验结果26-30
- 3.1 SHG44胶质瘤干细胞镜下形态26-27
- 3.2 胶质瘤干细胞标志物鉴定27-28
- 3.3 不同浓度ISL对SHG44人脑胶质瘤干细胞抑制的影响28-30
- 4 讨论30-32
- 实验三 异甘草素对SHG44人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的影响及作用分子机制32-43
- 1 材料与方法32-33
- 1.1 实验材料32
- 1.2 主要实验仪器32
- 1.3 主要实验试剂32-33
- 2 实验方法33-37
- 2.1 SHG44人脑胶质瘤细胞的培养33
- 2.2 SHG44人脑胶质瘤干细胞培养33-34
- 2.3 实验分组34
- 2.4 免疫荧光染色标记分化胶质瘤干细胞34
- 2.5 异甘草素作用下SHG44人脑胶质瘤干细胞形态观察34-35
- 2.6 Western bliot方法步骤35-36
- 2.7 Real-time PCR方法步骤36-37
- 2.8 统计学分析37
- 3 实验结果37-41
- 3.1 ISL诱导胶质瘤干细胞分化情况37-40
- 3.2 流式细胞术检测细胞周期结果40
- 3.3 Real-time PCR检测结果40-41
- 4 讨论41-43
- 结语43-45
- 参考文献45-48
- 文献综述一 异甘草素抗胶质瘤作用机制的研究进展48-54
- 参考文献51-54
- 文献综述二 Notch1通路介导胶质瘤干细胞耐药的研究进展54-61
- 参考文献57-61
- 致谢61-62
- 攻读硕士研究生期间主要成果62
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