基于干细胞的新型靶向复合生物基因载体的构建与其对缺血性脑卒中的治疗研究

发布时间：2017-05-01 16:09

  本文关键词：基于干细胞的新型靶向复合生物基因载体的构建与其对缺血性脑卒中的治疗研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：以靶向药物转运体系(TDDS)的理念,将特异性针对脑部病变组织的靶向肽通过适当的修饰使其有效连接到骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)表面,介导干细胞的主动靶向,同时采用非病毒载体高效安全地导入治疗基因,构建全新的能趋向脑部疾病、携载基因而自身又具有神经生长治疗作用的复合功能生物载体,并结合安全性评价等,全面评估MSCs作为脑靶向生物载体的可行性及其针对缺血性脑卒中的治疗前景。方法：1、合成N端修饰棕榈酸的脑靶向肽段CLEVSRKNC,以棕榈酸为锚点修饰到细胞膜表面,并筛选出最佳的修饰条件；2、利用流式细胞技术及荧光显微成像技术对靶向肽修饰的干细胞(Pep-MSCs)进行表征,MTT法考察靶向肽细胞毒性,进一步考察靶向肽修饰对MSCs神经分化潜能的影响,明确靶向肽的修饰效率和生物安全性；3、建立体外神经元细胞和星形胶质细胞的氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,考察Pep-MSCs的体外迁移,同时考察Pep-MSCs对受损神经细胞的保护作用；4、建立大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,利用小动物活体成像技术和组织切片技术,考察Pep-MSCs对于脑部缺血病灶的靶向作用,以及Pep-MSCs在MCAO模型大鼠体内的分布；5、利用已经建立的非病毒载体转染体系,采用自主合成的非病毒基因载体精胺-普鲁兰糖(spermine-pullulan, SP)对MSCs进行转染,考察转染效率；6、结合miR-133b的转染和靶向肽修饰,在MCAO大鼠尾静脉移植携载miR-133b的Pep-MSCs (Pep-133b-MSCs)后,通过神经功能评分(mNSS)和组织切片观察,评价niR-pep-MSCs的治疗效果。结果：成功构建复合功能细胞基因载体Pep-MSCs,流式细胞技术测定靶向肽有较高的修饰效率,激光共聚焦显微镜观察表明靶向肽成功地修饰到了细胞膜表面,MTT检测和MSCs神经分化功能评价均表明此修饰方法安全有效。在体外OGD模型中,与未经修饰的MSCs相比,Pep-MSCs显示出更高的迁移活性,同时靶向肽的修饰并未影响MSCs对于受损神经细胞的保护作用。将构建的Pep-MSCs尾静脉移植到MCAO大鼠体内后,小动物活体成像以及组织切片结果显示,靶向肽能介导MSCs到达缺血病灶,增强MSCs的归巢性,同时减少MSCs在非病灶组织的分布。另一方面,利用已经建立的非病毒转染体系对MSCs进行基因改造,非病毒载体SP能高效安全地转染miR-133b,并且转染miR-133b后的MSCs对受损神经细胞显示更好的保护作用。进一步地,结合基因转染和靶向肽修饰,携载miR-133b的Pep-MSCs在尾静脉移植到MCAO大鼠体内后显示了较好的治疗效果,mNSS评分显示miR-pep-MSCs有更好的神经保护的作用,组织切片结果表明基因转染和靶向肽修饰都未影响MSCs的神经分化功能。结论：成功构建Pep-MSCs,其对缺血性脑卒中病灶组织有很强的靶向性,作为复合功能基因靶向载体,其能携载治疗基因miR-133b到达病灶组织,又能发挥MSCs自身的治疗作用,在缺血性脑卒中的治疗中显示了很好的应用潜力。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 靶向肽 脑靶向 缺血性脑卒中 干细胞疗法 非病毒转染
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 全文缩写表13-19
• 引言19-24
• 第一章 靶向肽-骨髓间充质干细胞的构建24-37
• 1.1 仪器与试剂25-26
• 1.1.1 仪器25
• 1.1.2 试剂25-26
• 1.1.3 实验动物26
• 1.2 实验方法26-29
• 1.2.1 原代MSCs的制备和培养26-27
• 1.2.2 棕榈酸(Palmitic acid,PA)-多肽-MSCs的修饰27
• 1.2.3 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)检测27-28
• 1.2.4 大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的建立28
• 1.2.5 脑提取液的制备28-29
• 1.2.6 MSCs神经分化29
• 1.2.7 数据分析29
• 1.3 实验结果与讨论29-35
• 1.3.1 PA-peptide修饰条件的筛选29-32
• 1.3.2 PA-peptide修饰MSCs的表征32-33
• 1.3.3 PA-peptide修饰对MSCs生物活性的影响33-35
• 1.4 本章小结35-37
• 第二章 靶向肽修饰骨髓间充质干细胞的靶向性考察37-53
• 2.1 仪器与试剂37-39
• 2.1.1 仪器37-38
• 2.1.2 试剂38
• 2.1.3 实验动物38-39
• 2.2 实验方法39-41
• 2.2.1 原代培养星形胶质细胞(Astrocyte)39
• 2.2.2 Pep-MSCs体外迁移能力的考察39-40
• 2.2.3 MCAO模型的建立及鉴定40
• 2.2.4 Pep-MSCs的体内靶向性考察40-41
• 2.2.5 数据分析41
• 2.3 实验结果与讨论41-52
• 2.3.1 Pep-MSCs的体外趋向性考察41-46
• 2.3.2 Pep-MSCs的体内靶向性考察46-52
• 2.4 本章小结52-53
• 第三章 携载治疗基因的复合功能脑靶向载体对缺血性脑卒中治疗效果的评价53-69
• 3.1 仪器与试剂53-55
• 3.1.1 仪器53-54
• 3.1.2 试剂54
• 3.1.3 实验动物54-55
• 3.2 实验方法55-58
• 3.2.1 SP/RNA复合物的制备55
• 3.2.2 转染效率的评价和细胞毒性测试55
• 3.2.3 携载miR-133b的MSCs对于受损星形胶质细胞的保护作用55-56
• 3.2.4 干细胞移植和行为学测试56-57
• 3.2.5 组织学分析57
• 3.2.6 MSCs体内神经分化能力评价57
• 3.2.7 数据分析57-58
• 3.3 结果与讨论58-67
• 3.3.1 miR-133b的转染58-62
• 3.3.2 转染miR-133b的MSCs对受损星形胶质细胞的保护作用62-63
• 3.3.3 缺血性脑卒中的体内药效学评价63-67
• 3.4 本章小结67-69
• 全文总结69-72
• 参考文献72-81
• 综述81-137
• References116-137
• 作者简历137-139

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张贵斌;邱张;徐运兰;王伟;谢敏杰;;选择性CDK抑制剂对大鼠局灶性脑缺血后胶质增殖及疤痕形成的抑制作用[J];神经损伤与功能重建;2006年03期

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本文编号：339231