利用CRISPR/Cas9建立胆碱能神经元GFP特异性标记的人类胚胎干细胞系

发布时间：2021-12-17 01:10

　　胆碱能神经元（cholinergic neuron）是能合成乙酰胆碱并且以乙酰胆碱（Ach）为递质的神经元,在体内的分布非常广泛。中枢神经系统中的胆碱能神经元与学习、记忆以及注意力密切相关。胆碱能神经元的病变会引起阿尔茨海默症等严重的神经退化性疾病。获得胆碱能神经元特异标记的细胞系,可以更好地了解胆碱能神经元的分化、生理生化特性及引起阿尔茨海默症等严重的神经退化性疾病的病理机制。然而,已有的能够特异性标记胆碱能神经元的细胞均为动物来源,缺乏相应的人来源的细胞系。为了获得特异性标记的胆碱能神经元人源细胞系,本文利用最新的基因编辑技术—CRISPR（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）/Cas9系统构建了由胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）基因内源性启动子驱动zsGreen的胆碱能神经元特异性标记的人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）。ChAT-zsGreen细胞系在ES阶段时具有干性且无绿色荧光蛋白表达,而当其分化成胆碱能神... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 胆碱能神经元的研究
        1.1.1 胆碱能神经元的功能
        1.1.2 与胆碱能神经元相关的疾病
        1.1.3 胆碱能神经元与睡眠相关方面
    1.2 CRISPR/Cas9技术的研究
        1.2.1 常用基因编辑技术
        1.2.3 CRISPR/Cas9的相关应用
    1.3 Cre/LoxP与内源性启动子模型的应用
第2章 实验材料
    2.1 实验设备和试剂耗材
        2.1.1 实验主要设备及器材
        2.1.2 试剂耗材
    2.2 抗体信息
    2.3 引物信息
    2.4 质粒信息
    2.5 细胞来源
第3章 实验方法
    3.1 ChAT基因序列信息获得
    3.2 质粒构建
        3.2.1 同源重组质粒的设计
        3.2.2 同源重组质粒的构建
        3.2.3 Cas9质粒的设计
        3.2.4 Cas9引导序列的获得
        3.2.5 Cas9质粒的构建
        3.2.6 感受态转化
        3.2.7 菌落鉴定
    3.3 细胞准备
        3.3.1 293ft细胞常规培养
        3.3.2 H9-ESC细胞常规培养
    3.4 T7酶切检验Cas9质粒的作用
        3.4.1 293FT的转染
        3.4.2 T7酶切实验
    3.5 ChAT基因标记的细胞系的筛选
        3.5.1 H9-ES细胞的电转
        3.5.2 细胞系的药物筛选
        3.5.3 细胞系的基因鉴定
    3.6 ES细胞向胆碱能神经元的诱导分化
    3.7 免疫荧光染色
第4章 结果与分析
    4.1 同源重组与Cas9质粒的验证
        4.1.1 同源重组质粒的获得
        4.1.2 Cas9质粒的作用效果
    4.2 H9-ESC细胞系免疫组化鉴定
    4.3 ChAT基因标记的ES细胞系的鉴定结果
        4.3.1 ChAT基因标记的ES细胞系的PCR鉴定
        4.3.2 Ch AT 基因标记的 ES 细胞系的测序鉴定
        4.3.3 ChAT基因标记的ES细胞系的免疫染色鉴定
        4.3.4 ChAT基因标记的ES细胞系的荧光表达情况
    4.4 ChAT基因标记的ES细胞系向胆碱能神经元的诱导分化
        4.4.1 ChAT基因标记的ES向NSC分化
        4.4.2 ChAT-zsGreen NSC细胞的荧光表达情况
        4.4.3 NSC向胆碱能神经元分化
第5章 讨论
致谢
参考文献



本文编号：3539134