miR-129-5p靶向Wnt5a调控PKC/ERK/NF-κB和JNK信号通路抑制胶质瘤发生发展的机制研究

发布时间：2021-12-19 04:08

　　背景与目的:神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,且预后极差。传统治疗手段如手术、化疗、放疗等效果难以使人满意。非编码小分子RNA（miRNA）是一类内生的、参与基因转录后水平调控的RNA,其对细胞的增殖、分化、凋亡以及个体发育等均有一定的调控作用,同时其还与肿瘤的发生和发展存在紧密的关联。另外,人体内部分信号通路的异常表达也与胶质瘤密切相关。据相关研究显示,miRNA所调控的Wnt信号通路有望成为神经胶质瘤诊断的潜在靶点。但是,miRNA调控Wnt信号通路具体机制尚未完全明确。本研究拟对miR-129-5p在神经胶质瘤中通过调控Wnt信号通路发挥的作用及相关机制做进一步探讨。方法:通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析人胶质瘤样本中miR-129-5p的表达水平。运用CCK8细胞毒性活性检测法（CCK-8）、流式细胞术、Ed U细胞增殖检测法、血管生成检测、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验、体外3D迁移和干细胞球形成实验来评估miR-129-5p在多形性胶质母细胞瘤（GBM）中的作用。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA-Ch IP（染色质免疫沉淀）实验验证Wnt5a是否是mi... 

【文章来源】：南京医科大学江苏省

【文章页数】：91 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

神经胶质瘤中miR-129-5p的表达下调

33图2. miR-129-5p直接靶向作用于Wnt5A. 维恩图显示miR-129-5p通过五种不同的预测算法TargetScan，miRDB，PITA，miRanda和miRWalk直接作用于靶目标Wnt5a。 B. 对Wnt5a-3'UTR中miR-129-5p靶序列的预测显示，构建突变的Wnt5a-3'UTR靶序列。 C. 用Wnt5a-3'UTR-WT或Wnt5a-3'UTR-MUT报告基因以及40nM或80nM miR-129-5p或miR-NC模拟物转染的细胞的荧光素酶测定（每组分别做三次独立实验，每次重复六遍）。D. 使用过量表达miR-NC或miR-129-5p的N3或U251细胞中的Pan-Ago2抗体对Ago2 /RISC（RNA诱导的沉默复合物）进行免疫沉淀（左）。 IgG作阴性对照，β-actin用作组内对照。RT-qPCR分析显示，与对照组相比，过表达miR-129-5p的N3或U251细胞中掺入RISC的miR-129-5p量明显升高。 U6 RNA用作内部对照，对

图3. miR-129-5p通过靶向Wnt5a来抑制GBM的细胞增殖和血管生成A. 用Wnt5a质粒载体转染N3/miR-129-5p，K3/miR-129-5p和U251/miR-129-5p细胞，蛋白质免疫印迹法对Wnt5a转录水平进行分析（每组分别做三次独立实验，每次重复六遍）， GAPDH作为内参对照。 B.未经转染或用pcDNA3.1-Wnt5a质粒（Wnt5a）转染的miR-NC-或miR-129-5p-转染的N3或U251细胞的集落形成能力（每组分别做三次独立实验，每次重复六遍）。比例尺为2.5毫米。C.miR-129-5p的过表达抑制细胞增殖，而在有外源性Wnt5a作用时，miR-129-5p的过表达对N3和U251细胞增殖的抑制作用得以恢复（每组分别做三次独立实验，每次重复六遍）。 D. 对miR-NC，miR-129-5p或miR-129-5p加Wnt5a转染的N3和U251细胞进行EdU增殖分析检测（每组6个重复，每组分别做3个独立实验）。比例尺为100μm。 E. 用miR-NC，miR-129-5p或miR-129-5p加Wnt5a转染N3和U251 GBM细胞后3天，对细胞周期进行测定（每组分别做三次独立实验，每次重复六遍）。F. miR-NC，miR-129-5p或miR-129-5p模拟物加Wnt5a转染N3或U251


本文编号：3543737