Pur α蛋白在癫痫所致DNA损伤与修复中作用的研究
本文关键词：Pur α蛋白在癫痫所致DNA损伤与修复中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的研究Purα蛋白通过慢病毒载体对匹罗卡品诱导癫痫大鼠所致DNA损伤的保护作用,以及Purα蛋白在DNA损伤修复中的作用。材料和方法实验动物选择经过宁夏医科大学的伦理委员会审查批准,按照相关的动物实验操作准则进行试验。实验动物均选择雄性Sparague-Dawley(SD)大鼠。条件为:清洁级成年大鼠,6~8周,体重在220~250g之间。饲养条件:避光,适宜的温度和湿度24小时昼夜循环,安静,单笼,免费的食物和水平衡饲养条件下1周,以消除对环境的影响。60只SD大鼠随机分为Purα过表达组、PurαSi RNA组、空载体组及空白对照组共四组,每组15只。随机选取SD实验大鼠,以按照40mg/kg体重给药剂量腹腔注射1%的戊巴比妥钠溶液。然后参照Pacino’s等的大鼠脑立体定位图谱,确定左侧海马CA1区(坐标:前囟后3.7mm,旁开1.2mm,深度3.6mm),用微量注射器缓慢推注3μL慢病毒悬液(5×108TU病毒颗粒)。对照组按上述同样方法和坐标,注射等体积的生理盐水以完成手术操作。手术完毕将其放回笼内单笼饲养;术后连续3天腹腔注射青霉素5万U/d预防感染。注射病毒二周后每组随机选取6只大鼠断头取脑,剥离出海马组织,通过荧光切片和Western Blotting证实Purα慢病毒已经在海马组织表达;其余每组大鼠用匹罗卡品诱导癫痫;根据由孙涛教授主编《岛叶癫痫》大鼠癫痫发作分级及Racine评分标准为依据来判定癫痫发作级别,若癫痫发作达到Ⅲ~Ⅴ级则视为成功。若癫痫未发作或发作没有达到Ⅲ级则按要求每30min增加注射一次匹罗卡品,增加剂量为10mg/kg,补充的总注射次数最多不超过4次。癫痫发作1小时后观察记录大鼠的行为学变化并进行实验取材。一部分SD大鼠断头玻璃脑组织取海马CAI区组织进行冻存;一部分SD实验大鼠行活体灌注取材石蜡包埋;取材进行免疫组织化学检测γH2AX表达水平;通过Western-Blot检测Purα,Parp-1,Ku80和XRCC4的表达变化水平。统计分析使用SPSS20.0软件比较分析,所得实验的数据以X士S来表示。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)数据统计比较,多组间的比较采用LSD法进行均数间的两两比较,当各组的方差不齐时用Dunnett法进行均数间的两两比较。实验结果以P0.05为有统计学意义。实验结果1.得出的行为学结果:进行癫痫诱导后大鼠开始表现为持续性的抖动、间断的面肌抽搐、咀嚼,随后出现湿狗样抽动、双侧前肢打转后跌倒,症状明显者,可出现反复性的旋转。2.冰冻切片:海马CA1区注射高滴度的Purα慢病毒颗粒2周后,在荧光显微镜下,可见海马组织呈现大量的被病毒感染的带有荧光的细胞出现,说明慢病毒感染是成功的。3.免疫组织化学:在匹罗卡品诱导大鼠癫痫发作1小时后,大鼠海马组织中可见DNA损伤的标志性蛋白γH2AX的表达增高。在各组植入慢病毒二周行匹罗卡品诱导癫痫后,Purα过表达组的γH2AX阳性染色细胞数目要远远低于空载组和诱导癫痫组(p0.01);而Purα沉默组的γH2AX阳性染色细胞的数目则远远高于空载组和对照组(p0.01),二者之间有明显的统计学意义;而空载组与对照组相比则没有明显的统计学意义(p0.05),说明Purα对癫痫发作所导致的DNA损伤有保护作用,沉默Purα基因的表达,可使得癫痫诱导的DNA损伤加重。4.Western-Blot:Parp-1,Ku80和XRCC4的表达水平,与对照组和空载组比较,在Purα沉默组有着非常明显的增高,而在Purα过表达组则明显降低,二者之间有着显著性的差异(p0.01)。对照组与空载组则未见明显的差异(p0.05)(见图6-7)。说明Purα对癫痫所诱导的DNA损伤有保护作用。结论匹罗卡品致痫大鼠早期可引起海马组织中的DNA损伤,Purα对癫痫所诱导的DNA损伤有保护作用。
【关键词】：癫痫 人转录因子活性蛋白α 匹罗卡品
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1
【目录】：
- 摘要4-6
- ABSTRACT6-9
- 中英文缩略词表9-11
- 前言11-13
- 材料和方法13-27
- 结果27-34
- 讨论34-38
- 结论38-39
- 参考文献39-43
- 综述43-58
- 综述参考文献52-58
- 致谢58-59
- 攻读学位期间发表的学术论文59-60
- 个人简历60
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本文编号：355242
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