mTOR信号通路通过CD44促进损伤类神经元突起生长的研究

发布时间：2017-05-11 15:00

  本文关键词：mTOR信号通路通过CD44促进损伤类神经元突起生长的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：中枢神经损伤后,由于缺血、缺氧和炎症反应引起神经元死亡,神经元胞体、轴索和髓鞘发生凋亡、变性、坏死。由于神经元再生能力低下,一旦损伤,轴突很难再生,而轴突生长是神经损伤后再生的标志。几十年来科学家都在致力于寻找神经损伤后轴突再生障碍的因素以及如何促进轴突再生。越来越多的证据表明,神经元再生能力是决定再生成败不可缺少的关键因素。研究证实,mTOR信号通路的活性是影响成熟神经元轴突生长能力的关键因素,mTOR活性的不足是中枢神经系统轴突再生障碍的主要原因,P13K/Akt/mTOR通路是调节神经元再生能力的重要信号通路,但其作用机制尚不清楚。为此,本研究利用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为体外神经细胞模型,通过诱导其分化为具有成熟神经元特性的细胞,使其在形态、生理功能与正常神经细胞相似。通过H_2O_2诱导其氧化应激损伤建立类神经元细胞损伤模型,利用siRNA沉默PTEN基因从而激活mTOR通路,应用形态学和分子生物学技术阐明mTOR信号通路通过CD44增强神经元生长能力,参与神经损伤后轴突生长锥的生成,进而促进损伤轴突的再生。方法:首先通过10μM全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)对SH-SY5Y细胞诱导促进其向神经元方向分化。利用MTT方法确定H_2O_2的浓度,建立神经细胞氧化应激损伤模型,在氧化损伤的基础上我们利用PTEN特异性siRNA对PTEN进行干扰。我们分别设立:诱导对照组、H_2O_2组、H_2O_2+NC、H_2O_2+PTEN-RNAi组。利用荧光显微镜观察各组荧光强度确认转染效率;利用RT-PCR的方法检测PTEN mRNA的转录水平,Western blot方法检测雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化核糖体(p S6k)的蛋白表达水平;同时利用RT-PCR和Western blot的方法分别检测CD44 mRNA、CD44蛋白的表达情况;并利用Phalloidin(鬼笔环肽)荧光特异性标记肌动蛋白(F-actin)观察各组细胞生长锥和突起的变化。利用共同干扰的方法同时沉默PTEN、CD44,观察共同干扰组细胞生长锥和突起的变化。结果:10μM ATRA诱导SH-SY5Y 72 h与未诱导组相比细胞突起明显增长、分化程度增强。当H_2O_2浓度为50μM、100μM作用细胞24h时细胞在形态和存活率和对照组相比几乎没有变化,当H_2O_2浓度为200μM作用24h时,我们发现H_2O_2可以诱导SH-SY5Y细胞形态、存活率的改变:与对照组相比H_2O_2诱导组细胞出现皱缩,胞质折光性差,边界模糊,突起缩短,部分细胞出现死亡,同时MTT结果显示细胞存活率为74%。因此在实验中我们采用200μM H_2O_2处理SY5Y细胞24h为理想模型条件,成功构建细胞氧化应激损伤模型。诱导细胞在氧化损伤的基础上我们对PTEN基因特异性干扰,结果显示:与诱导对照组、H_2O_2组、H_2O_2+NC组相比,PTEN干扰组PTEN mRNA转录水平明显下调,差异显著(P0.01),mTOR、p S6k蛋白表达水平明显升高,差异显著(P0.05);PTEN干扰组CD44 mRNA的转录水平、CD44蛋白表达水平与未干扰组相比明显上调,差异显著(P0.05)。对各组细胞每个生长锥丝状伪足数目及细胞突起长度测量统计分析结果显示:对照诱导组细胞突起较多且长,生长锥较多,呈片状和丝状;H_2O_2损伤组细胞及H_2O_2+NC组细胞突起收缩变短,末端的生长锥收缩成球状,丝状伪足数目与诱导对照组相比明显减少,差异显著(P0.05),突起长度也明显比诱导对照组短,差异显著(P0.05);H_2O_2+PTEN-RNAi组细胞突起与H_2O_2损伤组和H_2O_2+NC组相比生长锥多分成叉状、突起末端球状的生长锥有丝状伪足的生长,丝状伪足的数量明显增加(P0.05),突起明显增长(P0.05)。共同沉默PTEN、CD44的结果显示:共同干扰组与对照组相比PTEN mRNA转录水平明显下调(P0.01),mTOR、p S6k蛋白表达水平明显升高(P0.05);CD44 mRNA的转录水平、CD44蛋白表达水平明显下调(P0.05);细胞生长锥多呈球状或者棒状,丝状伪足数目明显少于PTEN单独干扰组(P0.05),突起长度也明显短于PTEN单独干扰组(P0.05)。结论:PTEN抑制可以激活mTOR通路,mTOR通路激活后通过CD44分子表达上调,促进氧化应激损伤后类神经元生长锥生长进而促进突起的生长。
【关键词】：中枢神经损伤 氧化应激 mTOR信号通路 CD44生长锥 突起生长
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 前言4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1.1 神经系统氧化应激损伤的研究现状13-14
• 1.2 中枢神经系统损伤修复的研究进展14-20
• 1.2.1 改善微环境促进轴突再生14-17
• 1.2.2 神经干细胞移植17
• 1.2.3 增加神经元再生能力可以更有效的促进损伤神经元的轴突再生17-20
• 1.3 新的生长锥的生成是轴突损伤后再生的必要条件20-23
• 第二章 材料与方法23-36
• 2.1 实验仪器23-24
• 2.2 实验细胞24
• 2.3 实验试剂24-26
• 2.4 实验试剂的配制26-27
• 2.5 实验方法27-36
• 2.5.1 SH-SY5Y细胞的培养27-29
• 2.5.2 MTT实验确定过氧化氢浓度建立氧化损伤细胞模型29-30
• 2.5.3 RNA干扰技术30
• 2.5.4 RT-PCR技术检测PTEN干扰后PTEN、CD44基因转录水平30-32
• 2.5.5 Western blot技术检测PTEN干扰后mTOR、Ps6k、CD44蛋白翻译水平32-34
• 2.5.6 Phalloidin荧光标记F-actin34
• 2.5.7 PTEN和CD44共同干扰技术34-35
• 2.5.8 图像分析及统计学处理35-36
• 第三章 实验结果与分析36-51
• 3.1 10 μM ATRA诱导SH-SY5Y细胞分化36
• 3.2 诱导细胞分化程度的鉴定36
• 3.3 SH-SY5Y细胞氧化应激损伤细胞模型的建立36-38
• 3.4 利用RNA干扰技术使PTEN表达下调并检测其转录水平38-39
• 3.5 PTEN基因下调后Western blot技术检测mTOR、pS6k蛋白表达水平39-41
• 3.6 mTOR通路激活对氧化损伤细胞生长锥和突起长度的影响41-43
• 3.7 检测实验各组CD44的表达43-44
• 3.8 PTEN和CD44共同干扰实验44-51
• 3.8.1 CD44 siRNA干扰效率的确定44-45
• 3.8.2 PTEN和CD44共同干扰后CD44和PTEN表达水平检测45-48
• 3.8.3 PTEN和CD44共同干扰后实验各组细胞生长锥和突起的生长情况48-51
• 第四章 讨论51-54
• 第五章 结论54-55
• 参考文献55-63
• 研究生期间取得的科研成果63-64
• 作者简介63
• 发表论文63-64
• 致谢64

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