S100A8和S100A9在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中增殖、迁移的作用及其机制的研究

发布时间：2022-01-09 08:00

　　目的:神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是婴幼儿及儿童时期具有高度恶性的第二常见实体瘤,占儿科恶性肿瘤的6%⁸%。S100A8和S100A9是钙结合蛋白S100家族中两个重要的成员,二者与多种肿瘤的发生和发展有密切的关系。但是它们对神经母细胞瘤细胞系的作用及机制却少有研究。本文探究了S100A8和S100A9对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移的作用及其生物学作用机制。方法:通过生物信息学分析得到S100A8和S100A9是与神经母瘤的发生发展有密切相关性的两个蛋白。通过构建携带绿色荧光蛋白标记的重组质粒,过表达组:S100A8-SBI-piggbac、S100A9-SBI-piggbac;低表达组:shRNA-S100A8（shS100A8或shA8）、shRNA-S100A9（shS100A9或shA9）,将携带目的基因的重组质粒及其载体质粒转染到神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中,得到高表达S100A8、S100A9和低表达S100A8、S100A9的稳定细胞系;通过平板克隆实验和MTT实验,检测实验组细胞和对照组细胞的增殖能力,测定细胞活力;采用划痕实... 

【文章来源】：青岛大学山东省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

S100A8过表达质粒图谱

7图 1-2 S100A9 过表达质粒图谱Figure 1-2 S100A9 overexpressed plasmid map0A8 和 shS100A9 低表达质粒的构建A8 和 shS100A9 目的片段的扩增不在 PCR 仪上进行。它们是先将A9 的上下游引物溶解稀释到 100uM。然后用退火缓冲液配制反物+20ul 下游引物+80ulddH2O+40ul 4X annealing buffer， 5min，冷却过夜。配制浓度为 1%的琼脂糖凝胶，通过凝胶电后的产物中分离出来。然后用普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂回收。同时，将酶切鉴定后的载体 shRNA 进行转化（DH5α 感进质粒抽提、定量和酶切。先用 BamH I 在 37℃条件下，酶切

青岛大学硕士学位论文用 EcoR I 在 37℃条件下，酶切 1h 后进行纯化。将酶切鉴定后的 8 和 shS100A9 扩增后的产物分别在琼脂糖凝胶上电泳后，进行亮的目的片段和载体在连接体系中的比例。然后连接（16℃、T4DNAhS100A8和shS100A9 与shRNA连接好的体系进行转化（Stbl3 感受前准备好的带有氨苄霉素（AMP）抗性的 LB 平板上，检查 LB 平出（倒置）。确认后，将 LB 平板置于培养箱中进行过夜培养。挑选一些进行菌落 PCR。把菌落 PCR 呈现阳性的 shS100A8 和 s挑取单克隆后，在加入 AMP 抗生素的 LB 培养基中进行摇菌。然无内毒素质粒小提中量试剂盒）、定量，最后用 XhoI 进行酶切鉴果呈阳性的质粒与合适的引物一起送测序，质粒测序委托于北京有限公司。所得到的质粒 shS100A8 见图 1-3，shS100A9 见图 1-


本文编号：3578293