硫酸软骨素二糖诱导的miRNAs在多发性硬化动物模型中的功能研究

发布时间：2017-05-13 05:05

  本文关键词：硫酸软骨素二糖诱导的miRNAs在多发性硬化动物模型中的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是一种多发于青壮年时期损伤中枢神经系统的自身免疫性疾病,其发病机制仍不清楚。目前普遍认为,MS的发病原因是自身免疫性T细胞穿过血脑屏障,引起了神经轴突脱髓鞘。并且已有的研究指出,硫酸软骨素二糖是硫酸软骨素糖蛋白的二糖降解产物,具有促进神经损伤修复的功能。因此,我们推测硫酸软骨素二糖可能具有治疗MS的功能。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类长度约为22bp左右,进化上高度保守的非编码RNA,其介导的转录后基因调控是表观遗传学修饰的重要机制之一。研究发现miRNAs能够通过靶向调节mRNA的降解或抑制mRNA翻译来调控其转录。最近大量的研究表明,miRNAs参与了MS发生、发展变化的内在机理,在MS患者的病灶处、体液、血清、血浆以及外周血细胞中多种miRNA均出现表达异常。还有研究证实,这些miRNA可以在靶向改造(敲除、敲入)自身免疫性T细胞模型中调节自身免疫性T细胞的激活基因,从而成为基因治疗MS的新靶点。所以,miRNAs可能在MS的发生和发展以及治疗的过程中起着重要作用。目的:本课题拟探讨硫酸软骨素二糖及其诱导的miRNAs对小鼠淋巴细胞CD44表达、淋巴细胞迁移以及对多发性硬化症小鼠模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)发生发展的作用及机制。方法:1.观察硫酸软骨素二糖对MOG多肽和百日咳毒素(Pertussiu Toxin,PTX)诱导的EAE小鼠细胞免疫学水平变化(淋巴细胞,浸润性细胞,IFN-γ细胞因子变化)以及分子生物学水平变化(CD44,mi R-29b,miR-199b,IL-17,FOXP3)。2.通过计算机模拟程序研究mi R-29b和miR-199b与CD44 mRNAs 3'非编码区序列的相互作用。3.通过电转化用miR-29b和miR-199b的类似物和拮抗剂感染小鼠脾脏淋巴细胞,通过实时荧光定量PCR技术和流式细胞术检测miR-29b和miR-199b对CD44表达的影响。4.将miR-29b和miR-199b类似物和拮抗剂电转化至EAE小鼠脾脏淋巴细胞,培养48小时后静脉注射过继免疫小鼠,14天后通过流式细胞术检测淋巴细胞内细胞因子的变化。结果:硫酸软骨素二糖能够抑制EAE的发生。EAE小鼠与对照组小鼠比较,体内CD44表达增高且miR-29b,miR-199b表达降低。EAE小鼠经硫酸软骨素二糖处理后EAE小鼠体内CD44的表达明显降低,而miR-29b和miR-199b的表达增高。体外电转化实验表明,miR-29b和miR-199b能够抑制淋巴细胞内CD44的表达同时能够抑制淋巴细胞的增殖。通过将mi R-29b和miR-199b感染后的EAE小鼠脾脏淋巴细胞过继免疫正常小鼠发现,miR-29b和miR-199b能够降低EAE小鼠体内IL-17的表达。从而可能抑制EAE的发生和发展。结论:硫酸软骨素二糖可以上调mi R-29b和miR-199b的表达,并能抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生发展。通过计算机模拟程序,我们发现miR-29b和miR-199b均可和CD44 mRNAs 3'非编码区序列结合。实验结果也表明miR-29b和miR-199b能够抑制CD44的表达,因此,可能抑制淋巴细胞的增殖和迁移,从而抑制EAE的发生发展。同时miR-29b和miR-199b能够调节EAE小鼠淋巴细胞内IL-17的表达,从而控制EAE的发展。
【关键词】：多发性硬化症 硫酸软骨素二糖 实验性自身免疫性脑脊髓炎 CD44 miRNA
【学位授予单位】：鲁东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.51;R-332
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第1章 前言14-18
• 1.1 研究背景14-17
• 1.2 研究目的17
• 1.3 总结17-18
• 第2章 MicroRNAs在多发性硬化症中的表达调控及其功能18-25
• 2.1 miRNAs在外周血和血浆中表达异常18-19
• 2.2 miRNAs在血液和外周血单核细胞中表达失调19
• 2.3 miRNAs在B细胞和单核细胞中表达异常19-20
• 2.4 miRNAs在大脑中表达异常20
• 2.5 miRNAs在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中表达异常20
• 2.6 MS病人中miRNA异常表达的显著特征20-21
• 2.7 miRNAs在MS中的调控21-22
• 2.8 miRNAs在MS中的功能22-23
• 2.9 miRNAs作为MS的诊断标记23
• 2.10 miRNAs作为MS的治疗靶点23-25
• 第3章 材料和方法25-35
• 3.1 实验材料25
• 3.1.1 实验动物25
• 3.1.2 主要实验仪器25
• 3.1.3 主要实验试剂25
• 3.1.4 引物序列25
• 3.2 实验方法25-35
• 3.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞的体外培养25-26
• 3.2.2 EAE模型的诱导26-28
• 3.2.3 RNA提取28
• 3.2.4 逆转录PCR检测28-30
• 3.2.5 Real-time PCR检测30-31
• 3.2.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞上清中IFN-γ 的含量31-32
• 3.2.7 RNA干扰32
• 3.2.8 MTT法检测淋巴细胞增殖率32-33
• 3.2.9 小鼠的过继免疫33
• 3.2.10 流式细胞术检测33-34
• 3.2.11 统计学处理34-35
• 第4章 结果与分析35-52
• 4.1 硫酸软骨素二糖抑制EAE的发生35-44
• 4.1.1 硫酸软骨素和硫酸软骨素二糖影响小鼠淋巴细胞的量35
• 4.1.1.1 脾脏淋巴细胞的变化35
• 4.1.1.2 血液淋巴细胞的变化35
• 4.1.2 硫酸软骨素和硫酸软骨素二糖在体外影响小鼠脾脏淋巴细胞的增殖35-36
• 4.1.3 硫酸软骨素和硫酸软骨素二糖影响经MOG刺激后脾细胞的增殖36-37
• 4.1.4 MOG多肽诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立37-38
• 4.1.4.1 体重的变化37
• 4.1.4.2 神经功能评分的变化37-38
• 4.1.5 硫酸软骨素二糖影响EAE小鼠体内淋巴细胞38-40
• 4.1.5.1 硫酸软骨素二糖对EAE小鼠血细胞的影响38
• 4.1.5.2 硫酸软骨素二糖抑制EAE小鼠脾脏淋巴细胞的增殖38-39
• 4.1.5.3 硫酸软骨素二糖降低EAE小鼠脑和脊髓浸润性淋巴细胞的量39-40
• 4.1.6 硫酸软骨素和硫酸软骨素二糖对EAE小鼠脾细胞体外培养的作用40
• 4.1.7 硫酸软骨素二糖对EAE小鼠脑浸润性细胞中micro RNAs表达的影响40-42
• 4.1.7.1 硫酸软骨素二糖上调EAE小鼠脑浸润细胞内miR-29b的表达41
• 4.1.7.2 硫酸软骨素二糖上调EAE小鼠脑浸润细胞内miR-199b的表达41-42
• 4.1.8 硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素对脾脏淋巴细胞基因表达的影响42
• 4.1.9 硫酸软骨素二糖影响EAE小鼠基因表达的42-44
• 4.1.9.1 硫酸软骨素二糖上调EAE小鼠脾细胞中FOXP3的表达42
• 4.1.9.2 硫酸软骨素二糖下调EAE小鼠脾细胞中IFN-γ 的表达42-43
• 4.1.9.3 硫酸软骨素二糖下调EAE小鼠脾细胞中IL-17 的表达43
• 4.1.9.4 硫酸软骨素二糖下调EAE小鼠脑浸润细胞内CD44的表达43-44
• 4.1.10 硫酸软骨素二糖对细胞因子IFN-γ 表达的影响44
• 4.2 miR-29b和miR-199b抑制EAE的发生44-52
• 4.2.1 通过计算机程序预测CD44的靶点miRNAs44-45
• 4.2.2 miR-29b和miR-199b抑制脾脏淋巴细胞CD44表达45-46
• 4.2.2.1 miR-29b类似物和miR-199b类似物抑制脾脏淋巴细胞细胞CD44表达45
• 4.2.2.2 miR-29b拮抗剂和miR-199b拮抗剂促进脾脏淋巴细胞细胞CD44表达45-46
• 4.2.3 miR-29b拮抗剂和miR-199b拮抗剂促进脾脏淋巴细胞细胞的增殖46-47
• 4.2.4 miR-29b和miR-199b对CD44表达的影响47-48
• 4.2.4.1 miR-29b类似物和miR-199b类似物对脾脏淋巴细胞CD44表达的影响47
• 4.2.4.2 miR-29b拮抗剂和miR-199b拮抗剂对脾脏淋巴细胞CD44表达的影响47-48
• 4.2.5 miR-29b对EAE的影响48-49
• 4.2.5.1 miR-29b作用后EAE小鼠的体重变化48
• 4.2.5.2 miR-29b作用后EAE小鼠的神经功能评分48
• 4.2.5.3 miR-29b作用后EAE小鼠脾脏淋巴细胞的变化48-49
• 4.2.6 miR-199b对EAE表达的影响49-52
• 4.2.6.1 miR-199b作用后EAE小鼠的体重变化49-50
• 4.2.6.2 miR-199b作用后EAE小鼠的神经功能评分50
• 4.2.6.3 miR-199b作用后EAE小鼠的CD4+T细胞的变化50-52
• 第5章 讨论52-54
• 5.1 硫酸软骨素二糖抑制EAE的发生52-53
• 5.2 miR-29b和miR-199b抑制EAE的发生53-54
• 小结54-55
• 参考文献55-61
• 附录A 中英文缩略词61-62
• 附录B 实验仪器62-63
• 附录C 实验试剂63-64
• 附录D 常用缓冲液及试剂的配置64-65
• 附录E ELISA检测方法65-66
• 附录F RNA提取方法66-67
• 附录G 琼脂糖凝胶电泳67-68
• 作者简历68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张天民;凌沛学;;硫酸软骨素的过去、现在和将来[J];食品与药品;2010年01期

2 王革;;评《硫酸软骨素》一书[J];中国生化药物杂志;2012年04期

3 马淑涛;张天民;;各类硫酸软骨素制备方法概述[J];中国医药工业杂志;1992年12期

4 朱瑞芬,童兴龙,李颖;硫酸软骨素的研制[J];中国医药工业杂志;2000年06期

5 魏莉;比色法测定复方硫酸软骨素片中硫酸软骨素的含量[J];河北医药;2005年05期

6 谢敏,郭玉忠,胡玉荣,许平辉;硫酸软骨素的提取与精制[J];郑州大学学报(医学版);2005年01期

7 汪敏,岳京立,穆伟;从鱼头中提取硫酸软骨素实验方法的研究[J];数理医药学杂志;2005年01期

8 苏玉永;王虎;李晓华;;比色法测定复方硫酸软骨素胶囊中硫酸软骨素的含量[J];中国医院药学杂志;2006年03期

9 赵振锋;段钢;;高效液相色谱方法中不同色谱柱测定硫酸软骨素的比较[J];中国生化药物杂志;2007年03期

10 马鸿媚;;反相高效液相色谱法测定鲨芪康胶囊中的硫酸软骨素[J];吉林医药学院学报;2008年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 张天民;凌沛学;;硫酸软骨素的过去、现在和将来[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年

2 张天民;凌沛学;;硫酸软骨素的过去、现在和将来[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

3 张天民;凌沛学;边玲;;硫酸软骨素生产工艺研究进展[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

4 高华;;硫酸软骨素及蛋白质的清洁化生产新工艺研究[A];2008年度山东省药学会药物化学与抗生素专业委员会年会会议论文及大会报告摘要[C];2008年

5 张青;凌沛学;;硫酸软骨素在眼科中的应用[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年

6 张青;凌沛学;;硫酸软骨素在眼科中的应用[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

7 徐庆阳;王振声;陈宁;王福荣;;硫酸软骨素提取纯化新工艺[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年

8 王德利;孟凡欣;郭伟良;李明明;王贞佐;;荧光分光光度法测定硫酸软骨素含量[A];第十五届全国分子光谱学术报告会论文集[C];2008年

9 马玉;李继珩;;硫酸软骨素的制备[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年

10 杨海霞;刘燕;刘彩霞;邢玉仁;于盛茂;;硫酸软骨素及其钠盐含量测定研究近况[A];中国药学会全国多糖类药物研究与应用研讨会论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 中国医保商会 荣嫡;硫酸软骨素市场渐入佳境[N];中国医药报;2010年

2 记者 杨俊坚;硫酸软骨素：竞争无序 行业谋变[N];医药经济报;2011年

3 本报记者 谢玲;中国硫酸软骨素产业国内消费市场有待开启欲走出产业链低端[N];中国食品报;2014年

4 ;利用各种动物软骨提取硫酸软骨素的生产技术[N];中国畜牧兽医报;2007年

5 张伦;国际订单几乎全在中国[N];医药经济报;2006年

6 通讯员 李艳辉 记者 钱宝琦 汤润清;不吃资源饭 靠科技闯市场[N];河北日报;2014年

7 本报记者 陆悦;亟待走出产业链低端[N];中国医药报;2014年

8 王乐民;输美肝素钠中查出多硫酸软骨素[N];健康报;2008年

9 鲁涛 杨海军;硫酸软骨素行业发展现状[N];中国食品报;2014年

10 综合;输美“肝素钠”中查出“多硫酸软骨素”[N];医药经济报;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘春梅;硫酸软骨素的提取与纯化及性质研究[D];吉林大学;2007年

2 边玲;硫酸软骨素制备工艺改进[D];山东大学;2015年

3 赵丹;大马哈鱼（Oncorhynchus keta）中硫酸软骨素的提纯工艺与抗氧化活性研究[D];大连海洋大学;2015年

4 叶琳弘;鱿鱼软骨中硫酸软骨素的提取、纯化及降血脂活性的研究[D];福建农林大学;2015年

5 马新婷;硫酸软骨素二糖诱导的miRNAs在多发性硬化动物模型中的功能研究[D];鲁东大学;2016年

6 张雯;硫酸软骨素的提取和纯化方法的研究[D];江苏大学;2009年

7 周云;近红外光谱法用于硫酸软骨素含量测定的模型研究[D];山东大学;2009年

8 谢果凰;鲨鱼硫酸软骨素的分离提纯及其抗氧化功能的研究[D];宁波大学;2010年

9 徐瑞聪;羊软骨硫酸软骨素的提取分离及抗氧化活性研究[D];北京林业大学;2011年

10 李鑫;硫酸软骨素提取和纯化方法的研究[D];四川大学;2005年

  本文关键词：硫酸软骨素二糖诱导的miRNAs在多发性硬化动物模型中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：361605