TMZ/MGMT-shRNA共传递在胶质瘤中的作用研究

发布时间：2022-12-18 12:24

　　神经胶质瘤（glioma）是最为常见的原发性中枢神经系统肿瘤,化疗是其重要的辅助治疗手段,然而耐药基因的存在是导致化疗失败的重要原因。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是用于治疗胶质瘤的首选化疗药,易产生耐药性,O~6-m G DNA甲基转移酶（O~6-m G DNA methyltransferase,MGMT）是TMZ耐药的主要原因。针对这一问题,本研究建立了化疗药物/靶向耐药基因共传递体系,研究其对神经胶质瘤细胞增殖抑制作用。首先利用流式细胞技术筛选了TMZ抑制胶质瘤细胞增殖的工作浓度,发现TMZ对T98G、U251MG、SHG44等均有抑制作用,呈现浓度依赖的方式,且以T98G抑制增殖所需的药物浓度高,U251MG次之。在上述神经胶质瘤细胞中存在內源性MGMT表达,以T98G和U251MG表达量较高。随后,利用RNA干涉技术构建了MGMT-sh RNA-284和MGMT-sh RNA-396,在慢病毒载体介导下,MGMT-sh RNA-284具有明显的沉默內源性MGMT作用,能够提高胶质瘤细胞U251MG对TMZ的敏感性。在基因治疗策略中病毒载体存在潜在风险,我们联合... 

【文章页数】：37 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 神经胶质瘤治疗现状
    1.2 替莫唑胺是临床首选的化疗药物，容易产生耐药
    1.3 MGMT高表达是胶质瘤细胞对TMZ耐药的主要原因
    1.4 阳离子纳米载体用于基因传递
    1.5 基因和药物共传递系统
    1.6 立题依据及研究意义
2 材料和方法
    2.1 细胞株、菌种和载体
    2.2 主要试剂
    2.3 实验仪器
    2.4 细胞复苏及培养
    2.5 RNA提取及RT-PCR检测
        2.5.1 细胞总RNA提取
        2.5.2 反转录合成cDNA
        2.5.3 RT-PCR
    2.6 动物细胞全蛋白提取
    2.7 SDS-PAGE电泳
    2.8 沉默载体构建
        2.8.1 靶点oligo片段的制备
        2.8.2 载体双酶切
        2.8.3 酶切产物凝胶回收
        2.8.4 连接
        2.8.5 转化
        2.8.6 菌液PCR鉴定
        2.8.7 采用“试剂盒”做大提质粒
    2.9 慢病毒包装
    2.10 细胞增殖检测方法
    2.11 荧光素酶活性测定
    2.12 建立萤火虫荧光素酶动物模型
        2.12.1 T98MG-Luc细胞的构建
        2.12.2 T98G-Luc裸鼠脑原位瘤模型
3 结果与分析
    3.1 TMZ有效抑制胶质瘤细胞的增殖
    3.2 内源性MGMT在T98G和U251MG细胞中高表达
    3.3 MGMT-shRNA构建及其沉默效率检测
    3.4 MGMT-shRNA增强TMZ对胶质瘤细胞增殖的抑制作用
    3.5 改性的TMZA有效抑制神经胶质瘤细胞增殖
    3.6 非病毒载体PEI-PEG有效介导MGMT-shRNA-284 的表达
    3.7 PEI-PEG共传递TMZA/MGMT-shRNA抑制胶质瘤细胞增殖
    3.8 原位胶质瘤模型建立
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]多功能聚合物作为基因和化疗药物共传递系统的研究进展[J]. 王晶,李娟.  亚太传统医药. 2013(06)
[2]替莫唑胺耐药机制的相关因素分析[J]. 孙增峰,谷峰,李文良,马勇杰.  中华肿瘤杂志. 2011 (10)
[3]非病毒载体携带Cbfa1诱导成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究[J]. 孙杰,魏学磊,张志伟,马士超,马宝通,赵文君,张金利.  天津医药. 2011(08)
[4]纳米阳离子多聚物在基因载体系统的应用[J]. 郭毅,张爽男,康春生,常津.  高分子通报. 2005(05)
[5]聚乙烯亚胺包裹的磁性纳米颗粒用于基因载体的实验研究[J]. 韦卫中,吴华,徐春芳.  医学研究生学报. 2005(04)
[6]胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶基因突变分析[J]. 潘怡,齐雪岭,王雷明,董荣芳,张铭,郑丹枫,常青,钟延丰.  中华病理学杂志. 2013 (05)

博士论文
[1]Notch信号途径在胶质瘤发病机制中的作用研究[D]. 李三中.第四军医大学 2013
[2]基于低分子量聚乙烯亚胺的高效低毒基因载体[D]. 郑蒙.苏州大学 2012

硕士论文
[1]基因和药物共传递体系的制备与研究[D]. 关秀文.长春理工大学 2014
[2]PEG修饰药物新方法及PEI-g-PEG类共聚物的研究[D]. 庄小璐.华东师范大学 2007
[3]原发性脑胶质瘤术后替莫唑胺化疗的临床观察[D]. 王能江.华中科技大学 2007



本文编号：3722049