mTOR通路通过CD44促进神经元再生的内在机制的研究

发布时间：2017-05-21 08:01

  本文关键词：mTOR通路通过CD44促进神经元再生的内在机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：神经损伤类疾病的治疗一直是困扰医学界的一大难题。目前，治疗神经损伤类疾病的方法大体包括细胞的替代治疗和改善神经受损后局部抑制性的微环境两个方面。由于中枢神经系统神经元损伤后再生失败的原因错综复杂，上述治疗手段的效果往往不能从根本上解决问题。因此，阐明神经元内在再生能力的机制，探究神经损伤轴突再生的相关通路仍然是神经损伤类疾病治疗的关键。本实验通过体外诱导SH-SY5Y细胞分化，使其具有成熟神经元的特征，从而用作本研究的体外神经细胞模型。通过用RNA干扰技术下调分化SH-SY5Y细胞中PTEN基因表达，从而使mTOR通路激活，检测相关CD44分子表达是否上调及其与轴突生长的内部联系，进一步探讨mTOR通路是否通过CD44分子促进轴突生长，进而提高神经元的再生能力。 方法：体外培养SH-SY5Y细胞，并用10μM全反式维甲酸(RTRA)诱导分化3d，用倒置显微镜观察诱导组SH-SY5Y细胞形态变化情况，并设立对照组。利用RT-PCR及免疫组织化学染色技术检测实验诱导组与对照组SH-SY5Y细胞微管相关蛋白(Microtubule associated protein MAP2)表达及转录情况，进而验证实验组与对照组细胞分化程度的差异；随后对分化成熟的细胞进行PTEN RNAi实验，利用荧光显微镜对各实验组细胞进行观察，检测实验干扰组的荧光转染效率；利用RT-PCR技术对干扰24h后各实验组细胞PTEN的转录水平进行检测；利用western blot技术对干扰36h后磷酸化核糖体(Ps6K)蛋白与雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达水平进行检测；利用RT-PCR技术检测CD44转录水平，并与对照组进行比较，观测CD44表达水平与轴突生长关系是否呈现正相关；将诱导后的细胞同时进行PTEN与CD44基因的共同干扰，并观察两种基因转录共同下调后，细胞轴突的长度变化情况。 结果： RT-PCR结果证实诱导3d的细胞与对照组相比较，MAP2的转录水平明显上调。免疫组织化学方法证实，诱导3d的细胞与对照组相比较MAP2阳性细胞数明显增加。随后我们用RNAi技术对诱导分化的SH-SY5Y细胞进行PTEN基因干扰，24h后用RT-PCR技术检测PTEN基因的转录水平，与对照组相比，其转录水平明显下调。36h后我们再次检测干扰后细胞的mTOR与Ps6K蛋白的表达水平，与阴性对照组和空白对照组相比，其蛋白表达水平明显上调，差异显著（p0.05）。干扰PTEN基因24h之后，发现实验组CD44转录水平上调，与阴性对照组和单纯诱导组相比差异显著（p0.05）。随后利用imageproplus6.0分别对各实验组细胞进行轴突长度测量，并将各组数据分别进行统计学分析。结果表明，实验干扰3d细胞的轴突长度明显长于单纯诱导组和阴性对照组细胞的轴突长度，差异显著（P0.05），当PTEN RNAi与CD44RNAi共同干扰时，PTEN单纯干扰组细胞轴突长度明显长于共同干扰组和单纯诱导组细胞的轴突长度，差异显著（P0.05）。 结论：mTOR通路激活后通过CD44分子表达上调促进神经细胞突起生长，从而促进神经元的再生。
【关键词】：mTOR通路 CD44 神经再生 轴突生长 神经损伤
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略词12-14
• 第一章 文献综述14-27
• 1.1 神经轴突生长抑制因子及其受体复合物研究进展14-17
• 1.1.1 轴突生长抑制因子14-16
• 1.1.2 相关抑制因子受体复合物研究进展16-17
• 1.1.3 改善局部微环境的治疗手段17
• 1.2 影响中枢神经元内源性再生能力的因素17-27
• 1.2.1 生长调控机制与神经再生18-19
• 1.2.2 mTOR 信号通路19-22
• 1.2.3 CD44 的研究进展22-27
• 第二章 材料与方法27-38
• 2.1 实验试剂27-28
• 2.2 实验仪器28-29
• 2.3 实验细胞29
• 2.4 实验试剂配制29-31
• 2.5 实验方法31-38
• 2.5.1 神经细胞模型的建立31-32
• 2.5.2 用 RT-PCR 技术及免疫组织化学方法检测诱导细胞的分化程度32-34
• 2.5.3 通过 RNA 干扰技术使 PTEN 表达下调34-35
• 2.5.4 Western blot 检测干扰 36h 后 mTOR，Ps6K 蛋白的表达水平35-36
• 2.5.5 RT-PCR 检测 CD44 及 TUBB3 转录水平36
• 2.5.6 统计学处理与图像的分析，轴突长度的测量36-38
• 第三章 实验结果38-46
• 3.1 全反式维甲酸（RTRA）诱导 SY5Y 细胞分化38
• 3.2 诱导细胞分化程度的鉴定38-39
• 3.3 应用 RNAi 技术使 PTEN 表达下调并检测其转录水平39-40
• 3.4 Western blot 技术检测 PTEN 基因下调后，mTOR 蛋白，Ps6K 蛋白表达水平40-41
• 3.5 免疫组织化学方法检测 Ps6K 蛋白表达水平41-42
• 3.6 PTEN 抑制后，mTOR 通路激活对 SY5Y 细胞突起长度的影响42-43
• 3.7 检测各实验组 CD44 转录水平43
• 3.8 检测各实验组 TUBB3 转录水平43-44
• 3.9 共同干扰实验44-46
• 第四章 讨论46-50
• 第五章 结论50-51
• 参考文献51-57
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果57-58
• 致谢58

【参考文献】

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1 申崇标;陈力学;刘宝松;周冀英;曾照芳;邵阳;;下调PTEN基因对全脑缺血再灌注大鼠神经元损伤的保护作用研究[J];解放军医学杂志;2010年07期

  本文关键词：mTOR通路通过CD44促进神经元再生的内在机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：383013