UCH-L1对HDAC6介导的tau蛋白功能性聚集体形成的影响

发布时间：2017-05-21 21:21

  本文关键词：UCH-L1对HDAC6介导的tau蛋白功能性聚集体形成的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是细胞内降解异常蛋白质的主要途径,它们监测、调控胞内蛋白质的变化,并能及时清除异常蛋白质。与tau蛋白相关的神经退行性疾病常表现为tau蛋白的异常修饰和在胞内的大量聚集,并且伴随着泛素-蛋白酶体降解途径功能障碍,不能有效清除胞内异常蛋白质,同时UCH-L1也会发生功能障碍。此时,自噬-溶酶体途径的活性会增加,异常蛋白质降解的代偿性途径发挥降解异常蛋白质功能。自噬-溶酶体途径不仅需要HDAC6、p62和动力蛋白等蛋白质分子,还需要ataxin3和Pohl等去泛素化酶的参与。并且,HDAC6也可以与去泛素化酶UCH-L1结合,但UCH-L1的具体作用以及是否会影响自噬-溶酶体途径尚未得知。本实验中,首先诱导HEK293/tau441细胞产生去泛素化酶UCH-L1表达异常和蛋白酶体功能障碍,即采用UCH-L1 siRNA抑制UCH-L1表达后,同时用2 μM的MG132处理HEK293/tau441细胞24r。随后采用Western Blot检测细胞内HDAC6和总tau蛋白含量的变化情况,用免疫沉淀检测HDAC6与泛素化tau蛋白结合的变化情况,以及用免疫荧光检测实验处理后各处理组tau蛋白功能性聚集体的形成情况。实验结果表明：(1)与对照组相比,UCH-L1 siRNA能抑制UCH-L1表达(抑制率为75%)；用MG132处理后,发现胞内HDAC6和总tau蛋白水平增加；(2)UCH-L1 siRNA和MG132同时处理细胞,与MG132组相比,HDAC6表达下调,总tau蛋白含量上升；(3)免疫沉淀结果显示,与对照组相比,MG132处理后,细胞内多聚泛素含量增加,泛素化tau蛋白含量增多,HDAC6与泛素的结合增加；(4)免疫沉淀结果显示抑制UCH-L1正常表达并抑制蛋白酶体活性后,与MG132实验组相比,细胞内泛素化tau蛋白含量继续增加,然而,HDAC6和泛素的结合下降；(5)免疫沉淀结果显示,与对照组相比,MG132处理后,胞内HDAC6与tau-5结合显著增加,同时抑制UCH-L1表达后,HDAC6与tau-5结合也表现为增加,但与MG132组相比表现为显著下降；(6)免疫荧光结果显示,MG132处理则能促使细胞内形成明显的tau蛋白聚集体结构,但是UCH-L1表达下降并抑制蛋白酶体活性后,tau蛋白虽然表现出一定的聚集趋势,但未能形成功能性聚集体结构。结论：上述结果表明蛋白酶体活性被MG132抑制后,胞内异常tau蛋白会形成聚集体经自噬-溶酶体途径降解,以减少对细胞的毒性作用；若同时抑制去泛素化酶UCH-L1表达、使其功能降低,会限制细胞内聚集体的形成,进而影响自噬途径的顺利进行和异常蛋白质的清除。本实验为UCH-L1参与自噬-溶酶体途径提供依据,为神经退行性疾病治疗提供新的靶点。
【关键词】：泛素碳末端水解酶L1 组蛋白去乙酰化酶6 泛素 tau蛋白聚集体 自噬-溶酶体途径
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 文中主要缩略词简表10-13
• 1 前言13-23
• 1.1 蛋白质降解系统13-16
• 1.2 泛素碳末端水解酶L1—UCH-L116-17
• 1.3 组蛋白去乙酰化酶6结构及其生物学功能17-20
• 1.4 微管相关蛋白tau及其生物学功能20-22
• 1.5 研究目的和意义22-23
• 2 材料与方法23-31
• 2.1 主要试剂和抗体23
• 2.1.1 主要试剂23
• 2.1.2 抗体23
• 2.2 主要仪器23-24
• 2.3 细胞培养24-25
• 2.4 细胞实验处理25-26
• 2.4.1 UCH-L1 siRNA转染实验25-26
• 2.4.2 加药处理26
• 2.5 免疫印迹(Western blotting,WB)26-28
• 2.5.1 收集蛋白样品(冰上操作)26-27
• 2.5.2 BCA法测蛋白浓度(冰上操作)27
• 2.5.3 免疫印迹27-28
• 2.6 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)(低温工作室中操作)28-29
• 2.7 免疫荧光(Immunofluorescence,IF)29-30
• 2.8 统计学分析30-31
• 3 结果31-38
• 3.1 不同浓度的UCH-L1 siRNA转染处理对UCH-L1表达水平的影响31-32
• 3.2 蛋白酶体活性抑制时,抑制UCH-L1表达HDAC6含量下降32
• 3.3 蛋白酶体活性抑制时,抑制UCH-L1表达总tau含量增加32-33
• 3.4 蛋白酶体活性抑制时,抑制UCH-L1表达HDAC6与泛素结合力下降33-34
• 3.5 蛋白酶体活性抑制时,抑制UCH-L1表达泛素化tau蛋白增加34-35
• 3.6 蛋白酶体活性抑制时,抑制UCH-L1表达HDAC6与tau蛋白的结合下降35-36
• 3.7 蛋白酶体活性抑制时,UCH-L1对tau蛋白聚集体形成的影响36-38
• 4 讨论38-43
• 4.1 UCH-L1表达下调对HDAC6含量的影响39-40
• 4.2 UCH-L1表达下调对胞内tau蛋白含量的影响40
• 4.3 UCH-L1表达下调影响tau、HDAC6和泛素三者之间的结合40-41
• 4.4 UCH-L1表达下调影响tau蛋白聚集体的形成41-43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-54
• 附录54-55
• 致谢55-56

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本文编号：384890