肌肉营养不良蛋白聚糖DG与Sedlin蛋白的相互作用

发布时间：2017-05-23 13:23

  本文关键词：肌肉营养不良蛋白聚糖DG与Sedlin蛋白的相互作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究旨在证明肌营养不良蛋白聚糖DG是否与Sedlin蛋白之间存在相互作用,以及进一步探寻DG中与Sedlin存在相互作用的具体结构域。并依次应用了质粒构建、酵母双杂交、免疫印迹、GST Pulldown、间接免疫荧光以及免疫共沉淀等实验技术,分别从酵母细胞、哺乳动物细胞以及体外三个层面对此加以证实,为探索DG蛋白和Sedlin蛋白的功能奠定一定的细胞学基础。方法在酵母双杂交实验中,我们依次构建DG的酵母表达质粒p GΑDT7-DAG1,p GBKT7-DΑG1,并分别与本实验室保存的Sedlin的酵母表达质粒p GBKT7-SEDL,p GΑDT7-SEDL共同转化至酵母细胞(ΑH109)中,然后在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培养基上进行营养筛选,并对生长出的克隆进行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定,通过观察克隆是否变蓝来证明DG是否与Sedlin存在相互作用。然后我们继续构建pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG真核表达质粒。在GST Pulldown实验中,将pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG单独转染到哺乳动物细胞(HEK 293T),然后提取细胞总蛋白,与本实验室保存的GST-Sedlin融合蛋白在体外混悬,收集谷胱甘肽珠子进行免疫印迹分析证明DG是否与Sedlin存在相互作用。在间接免疫荧光实验中,将pc DNΑ3.1-DΑG-FLΑG和pc DGFP-SEDL共同转染到哺乳动物细胞中(COS7),进行免疫荧光制片,通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察DG是否与Sedlin存在共定位现象。在免疫共沉淀实验中,将pc DNΑ3.1-DΑG1-FLΑG和pc DGFP-SEDL共同转染到哺乳动物细胞中(HEK 293T),提取细胞总蛋白,利用FLAG抗体孵育和琼脂糖珠沉淀后,收集珠子进行免疫印迹分析证明DG是否与Sedlin存在相互作用。接下来,我们又利用了上述同样的实验方法,进一步研究了DG的两个结构域(α-DG和β-DG)与Sedlin之间的相互作用情况。结果酶切鉴定结果和测序结果一致证明所需质粒构建成功。酵母双杂交实验显示,共同表达了DG和Sedlin两种蛋白的酵母细胞在SD3-培养基中能够正常生长,且克隆在进行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定后颜色变蓝,即证明二者存在相互作用。GST Pulldown实验显示,当用FLAG抗体免疫印迹后,实验组(GST-Sedlin+DG-FLΑG)能够检测到DG的存在,表明GST-Sedlin融合蛋白在体外条件下能够下拉DG蛋白,则证明二者存在相互作用。间接免疫荧光实验显示,DG在COS 7细胞主要分布在细胞质中,而Sedlin在细胞质和细胞核中都有分布,且二者在细胞质中存在明显的共定位现象。免疫共沉淀实验显示,当用GFP抗体免疫印迹后,实验组(Sedlin-GFP+DG-FLΑG)中能够检测到Sedlin-GFP的存在,表明FLAG抗体在沉淀DG-FLΑG的同时也将Sedlin-GFP共同沉淀下来,即证明二者存在相互作用。在进一步的研究中,GST-Sedlin融合蛋白在体外条件下也能下拉α-DG和β-DG蛋白;且α-DG和β-DG与Sedlin在COS 7的细胞质中也都存在共定位现象;且FLAG抗体在沉淀α-DG和β-DG的同时也能将Sedlin共沉淀下来,这一致表明α-DG和β-DG都与Sedlin存在相互作用。结论通过酵母双杂交、GST下拉技术、间接免疫荧光、免疫共沉淀等四种技术充分证实了肌营养不良蛋白聚糖DG和Sedlin蛋白在酵母细胞中、哺乳动物细胞中以及体外实验中都存在相互作用,且DG的两个结构域,即α-DG和β-DG都能与Sedlin蛋白存在相互作用,为进一步研究它们之间的关系奠定了基础。
【关键词】：肌营养不良蛋白聚糖 酵母双杂交 免疫荧光 免疫共沉淀
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R746.2
【目录】：

• 英文缩略表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 引言11-13
• 2 材料与方法13-39
• 3 结果39-52
• 4 讨论52-56
• 5 结论56
• 6 对本课题的进一步研究56-57
• 7 参考文献57-62
• 附录62-64
• 致谢64-65
• 综述65-77
• 参考文献72-77

【参考文献】

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1 巨红妹;张霞;王云华;;新型蛋白标签在分子生物学中的应用[J];中国病原生物学杂志;2011年08期

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本文编号：388091