脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立

发布时间：2024-04-16 19:33

　　人类文明的进步并未阻止传染病的肆虐,进入二十一世纪,传染病的防治仍是人类必须面对的巨大挑战。对传染病病原学的研究始终是一项具有重大意义的任务。近年来,生物学技术的迅速发展也使得传染病病原体的检测与鉴定技术得到飞速发展,每一项技术的革新对生命科学领域来说都是一次跨越。目前,众多分子生物学方法已成功应用于病原体检测中,如PCR技术、基因芯片技术、分子杂交技术等。相对于传统检测技术而言,新一代分子生物学技术具有操作简单、耗时短、检测效率高等特点,但是也存在相应的不足,如何避免这些不足并开发新技术已成为目前科研工作者的首要任务。在本研究中,我们将最初用于基因分型、突变位点检测、耐药位点分析等方面的多重PCR-Mass ARRAY技术应用于传染病病原体的高通量检测中,以15种可引起脑炎/脑膜炎症状的病原体以及16种可引起病毒性出血热的病毒为研究对象,建立脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术,实现此类病原体的多重、高通量、高特异性以及高灵敏度检测,服务于流行病学调查研究以及传染病病原体大规模筛查与鉴定。 实验方法：针对拟检测病原体,使用生物信息学方法对待检病原体的基...

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 引言
    1.1 脑炎/脑膜炎病原体简介
        1.1.1 虫媒性脑炎/脑膜炎病毒
        1.1.2 脑炎/脑膜炎细菌
    1.2 病毒性出血热病原体简介
        1.2.1 拉沙热病毒(lassa fever virus.Lassa)
        1.2.2 胡宁病毒(junin virus.Junin)
        1.2.3 马秋波病毒(machupo virus.Machupo)
        1.2.4 汉坦病毒(hanta virus.Hanta)
        1.2.5 新疆出血热病毒(crimeancongo hemorrhagic fever virus.CCHFV)
        1.2.6 马尔堡病毒(marburg virus.Marburg)
        1.2.7 埃博拉病毒(ebola virus.Ebola)
        1.2.8 登革病毒(dengue virus.DENV)
        1.2.9 裂谷热病毒(rift valley fever virus.RVFV)
        1.2.10 肺综合征出血热病毒(sin nombre virus.SNV)
        1.2.11 黄热病毒(yellow fever virus.YFV)
    1.3 病原体检测技术
        1.3.1 传统生物学技术
        1.3.2 现代分子生物学技术
    1.4 多重PCR-Mass ARRAY简介
        1.4.1 MALDI TOF MS
        1.4.2 Mass ARRAY
        1.4.3 iPLEX基因型分析法的工作原理
        1.4.4 多重PCR-Mass ARRAY的优势及应用
    1.5 研究内容与意义
2. 膜炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立
    2.1 实验材料
        2.1.1 样本
        2.1.2 试剂
        2.1.3 设备与耗材
    2.2 实验方法
        2.2.1 脑膜炎病原体保守序列分析与筛选
        2.2.2 内参基因的选择
        2.2.3 引物的设计、配制与测试
        2.2.4 质粒构建及验证
        2.2.5 病毒培养液的预处理
        2.2.6 临床标本的预处理
    2.3 多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立
        2.3.1 前PCR扩增
        2.3.2 SAP消化
        2.3.3 iPLEX延伸反应
        2.3.4 树脂纯化
        2.3.5 质谱检测
    2.4 多重PCR-Mass ARRAY检测技术的特异性与灵敏度
        2.4.1 峰图判读分析
        2.4.2 特异性结果分析
        2.4.3 灵敏度结果分析
        2.4.4 重复性结果分析
    2.5 病毒培养物的检测步骤与结果分析
        2.5.1 纯病毒标本多重PCR-Mass ARRAY实验标准流程
        2.5.2 纯病毒标本多重PCR-Mass ARRAY实验结果分析
    2.6 临床标本检测步骤与结果分析
        2.6.1 脑炎临床标本cDNA多重PCR-Mass ARRAY实验标准流程
        2.6.2 临床标本多重PCR-Mass ARRAY实验结果分析
    2.7 小结
        2.7.1 特异性
        2.7.2 灵敏度
        2.7.3 实用性
3. 出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立
    3.1 实验材料
        3.1.1 出血热病毒质粒标准品
        3.1.2 试剂
        3.1.3 设备与耗材
    3.2 实验方法
        3.2.1 出血热病毒保守序列分析、筛选以及内参基因的选择
        3.2.2 引物设计及测试
        3.2.3 构建重组质粒
        3.2.4 方法特异性、灵敏度及重复性验证
    3.3 出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立
        3.3.1 前PCR扩增
        3.3.2 SAP消化
        3.3.3 iPLEX延伸反应
        3.3.4 树脂纯化
        3.3.5 质谱检测
    3.4 实验结果分析
        3.4.1 特异性结果分析
        3.4.2 出血热病毒重组质粒灵敏度结果分析
        3.4.3 体系重复性结果分析
    3.5 小结
        3.5.1 特异性
        3.5.2 灵敏度
        3.5.3 可重复性
4. 讨论与结论
    4.1 讨论
        4.1.1 病原体保守序列选择的关键点
        4.1.2 引物设计的关键点
        4.1.3 实验结果的判定
    4.2 结论
        4.2.1 脑炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测
        4.2.2 出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测
        4.2.3 展望
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间科研成果



本文编号：3956582