HSPA12A在缺血性脑卒中保护作用研究

发布时间：2017-05-26 06:37

  本文关键词：HSPA12A在缺血性脑卒中保护作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的：脑缺血损伤,又称脑梗塞、脑卒中,是世界上死亡率第一、致残率第三的重大疾病。寻求新的保护脑缺血的基因并充分利用其改善脑缺血损伤功能,一直是我们亟待解决的重要任务。热休克蛋白是机体在受到不良环境因素刺激后大量产生并发挥重要作用的一组应激蛋白质A12A(HSPA12A)是一种新发现的热休克蛋白,属于HSP70家族中的一员。研究表明,HSPA12A转录本在哺乳动物脑组织中含量非常丰富,但其在脑组织中的作用却没有过相关研究。因此我们课题组通过构建hspal2a基因条件性敲除(Conditional knockout, cKO)小鼠以及制备脑缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)模型,研究HSPA12A是否参与脑I/R后的修复以及其在脑I/R后修复中所起的作用,以期为脑卒中的诊断和治疗提供一定的理论参考依据。方法采用hspal2a基因条件性敲除的小鼠为实验对象,通过构建脑i/R损伤模型,观察、比较小鼠I/R损伤后HSPA12A表达量的变化以及hspal2a基因缺失对小鼠脑I/R损伤的影响,从而探索HSPA12A在脑组织中的病理生理作用。1. HSPA12A蛋白的定位：采用免疫荧光法(Immunofluorescence, IF),将HSPA12A分别与神经元标记蛋白NeuN、β-TublinⅢ共染。2. HSPA12A在脑I/R后的水平变化：(1)动物水平上,采用拴线穿过小鼠左颈内动脉堵住大脑中动脉,缺血1 h,再灌注不同时间来诱导I/R模型。(2)在细胞水平上,通过将原代神经元细胞换入无糖培养基并放入乏氧培养箱中培养2h后,重新恢复正常培养24 h来诱导氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)模型。收集细胞,通过蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)以及实时定量PCR (Real time polymerase chain reaction, RT-PCR),分别检测HSPA12A的蛋白与mRNA表达量的变化情况。3.实验动物模型的构建：本课题组与南京大学模式动物研究合作,采用Cre-loxp系统,构建hspal2a条件性基因敲除小鼠,后者与Cre转基因鼠交配,得到spal2a基因敲除鼠。4.hspal2a基因敲除鉴定：(1)用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)确定小鼠的基因型；(2)用蛋白质免疫印迹法检测小鼠脑组织中HSPA12A蛋白表达水平；(3)用实时定量PCR测小鼠脑组织中HSPA12AmRNA的表达量；(4)免疫荧光染色检测HSPA12A蛋白荧光。5.脑I/R损伤程度的评定：(1)梗死面积：经过缺血1 h/再灌24 h后,取脑组织,均匀切成5片,用2%的氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium Chloride, TTC)染色,拍摄图片后统计梗死面积。(2)神经行为学评分：经过缺血1 h/再灌24 h后,通过观察小鼠精神状态、运动强度、触须反应、平衡度、对称性五项指标综合评分。(3)海马神经元损伤：缺血1 h/再灌24 h后,取脑组织经固定、包埋后制成石蜡切片,经过苏木精—伊红(HemotoxylinEosin Staining, HE)染色和尼氏(Nissl)染色后,观察比较海马神经元形态学变化。(4)神经元凋亡：缺血1h/再灌24h后,取脑组织制备石蜡切片后,采用TUNEL法染色,拍摄图片后统计凋亡细胞百分比。以及缺血1h/再灌3h后,免疫印迹法测定脑组织中促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。6.统计学分析：使用SPSS17.0进行数据处理。数据以平均值±标准差(χ±SD)表示,两组数据之间用均数检验(t检验),多组数据之间用单因素方差分析(ANOVA),P0.05表示有显著性差异。实验结果1. HSPA12A蛋白在小鼠脑组织中表达最高,且表达在神经元中。2. HSPA12A在I/R的脑组织、氧糖剥夺/复氧后的神经元中表达下降。3. Hspa12a基因缺失扩大脑I/R引起的脑梗塞面积。4. Hspa12a基因缺失加剧脑I/R引起的神经功能障碍。5. Hspa12a基因缺失加重脑I/R导致的海马神经元损伤。6. Hspa12a基因缺失促进脑I/R后神经细胞的凋亡。结论HSA12A在神经元细胞中表达,且参与脑I/R损伤过程,在维护脑I/R后的损伤修复中具有重要作用。
【关键词】：热休克蛋A12A 脑缺血/再灌注 神经元损伤
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 英文缩写和略语3-4
• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-23
• 1. 实验材料11-14
• 2. 实验方法14-23
• 结果23-34
• 讨论34-38
• 参考文献38-44
• 综述 热休克蛋白在脑组织中的保护作用44-49
• 摘要44
• 1. 引言44-45
• 2. 热休克蛋白的分类及其生物学特征45
• 3. 热休克蛋白的可能调节机制45-48
• 4. 展望48-49
• 研究生期间发表的文章49-50
• 致谢50

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本文编号：395974