神经细胞凋亡/变性中Akt/AMPK-mTOR和PP5/PP2A-MAPK信号转导及调控分子机理研究
发布时间：2024-05-20 21:18
本研究采用细胞培养、台盼蓝染色、TUNEL和DAPI染色、MDC染色、荧光蛋白标记、RNA干扰、DNA剪切、免疫组化、Western Blot分析等细胞和分子生物学技术及方法;以PC12细胞、小鼠原代神经元以及C57BL小鼠和SD大鼠为实验对象;系统地研究了在体和/或离体PD模型中以及离体镉染毒模型中神经细胞凋亡及自噬异常发生机理;解析了 Akt/AMPK-mTOR和PP5/PP2A-MAPK信号转导在神经细胞凋亡中的作用及其调控分子机理。结果如下:1 动物PD模型大脑SNc和海马回神经元凋亡涉及AMPK激活和Akt失活及mTOR通路抑制MPTP注射诱导C57BL小鼠PD亚急性模型及鱼藤酮灌胃构建SD大鼠PD模型。采用Western Blot检测脑组织Akt,AMPK、mTOR、Caspase-3和PARP等蛋白表达,免疫组化分析脑中SNc及海马回神经元TH+细胞表现,以及DAPI和TUNLE染色评估细胞凋亡。结果显示,MPTP和鱼藤酮诱导PD动物模型的脑组织mTOR信号通路均抑制而Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP显著增加;AMPKα磷酸化升高而Akt磷酸化...
【文章页数】：247 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
缩略词(Abbreviations)
摘要
Abstract
引言
第一部分 文献综述
第一章 神经细胞调亡及其相关神经变性疾病的研究现状
1 细胞凋亡的形态学特征
2 细胞凋亡的分子机制
3 细胞凋亡的生物学意义
4 细胞凋亡的检测方法
4.1 显微镜技术
4.2 TUNEL染色法
4.3 Hoechst和DAPI染色法
4.4 流式细胞分析法
4.5 Western Blotting检测
5 细胞凋亡与神经变性疾病的关系
6 小结
参考文献
第二章 神经变性疾病体内体外模型研究进展
1 帕金森病模型诱导剂概述
1.1 MPTP/MPP+
1.2 6-OHDA
1.3 鱼藤酮(Rotenone)
2 体内、体外帕金森模型的建立
2.1 6-OHDA诱导的帕金森病模型
2.2 鱼藤酮诱导的帕金森病模型
2.3 MPTP/MPP+诱导的帕金森病模型
2.4 基因编辑技术产生PD动物模型
3 阿尔茨海默病模型诱导剂概述
3.1 OKA
3.2 Wortmannin
3.3 Isoprenaline
3.4 Haloperidol
3.5 Colchicine
4 经典的阿尔茨海默模型建立
5 其他神经变性疾病模型的建立
6 小结
参考文献
第三章 神经细胞ROS、Ca2+/CaMKⅡ-mTOR信号转导与凋亡/变性发生的关系
0 ROS调控机制及其稳态
1 神经细胞ROS与凋亡/变性的关系
1.1 神经细胞ROS与凋亡/变性同线粒体的关系
1.2 神经细胞ROS与凋亡/变性关联细胞毒性分子
1.3 神经细胞ROS与凋亡/变性关联调控蛋白Bcl-2
2 Ca2+/CaMKⅡmTOR的分子结构
2.1 Ca2+/CaMKⅡ的分子结构
2.2 mTOR的分子结构
3 Ca2+/CaMKⅡ-mTOR信号转导网络
4 Ca2+/CaMKⅡ-mTOR信号转导与凋亡/变性的关系
5 小结
参考文献
第四章 神经细胞Akt/AMPK-mTOR信号通路作用及与凋亡/变性发生的关系
1 Akt的分子结构
2 AMPK的分子结构
3 Akt/AMPK-mTOR信号通路
4 神经细胞Akt/AMPK-mTOR信号通路与凋亡/变性的关系
4.1 神经细胞Akt-mTOR信号与凋亡/变性
4.2 神经细胞AMPK-mTOR信号与凋亡/变性
5 小结
参考文献
第五章 神经细胞PP2A/PP5-MAPK信号转导及与凋亡/变性的关系
1 PP2A的分子结构
2 PP5的分子结构
3 MAPK的分子结构
4 神经细胞PP2A-MAPK信号与凋亡/变性
5 神经细胞PP5-MAPK信号与凋亡/变性
6 小结
参考文献
第六章 神经细胞自噬与凋亡关系在神经变性疾病发生中的作用
1 细胞自噬的概念和过程
1.1 细胞自噬的概念
1.2 细胞自噬的过程
2 神经细胞自噬与凋亡的关系
3 神经细胞的自噬和凋亡与帕金森病的关系
4 神经细胞的自噬和凋亡与阿尔兹海默病的关系
5 神经细胞的自噬和凋亡与亨廷顿舞蹈病的关系
6 神经细胞的自噬和凋亡与肌萎缩侧索硬化的关系
7 小结
参考文献
第二部分 实验研究
第七章 动物PD模型大脑SNC和海马回神经元凋亡与Akt/AMPK/mTOR活性关系研究
1 材料和方法
1.1 主要试剂及药品
1.2 实验动物来源及造模
1.3 样品采集和处理
1.4 脑切片免疫组化分析
1.5 免疫印迹(Western blot)分析
1.6 数据分析
2 结果
2.1 MPTP诱导小鼠大脑SNc区的TH+细胞数目减少
2.2 MPTP诱导小鼠大脑SNc区神经元凋亡
2.3 鱼藤酮诱导大鼠大脑脑SNc及海马回神经元凋亡
2.4 鱼藤酮诱导大鼠纹状体AMPK/Akt/mTOR信号通路异常涉及凋亡
3 讨论
参考文献
第八章 神经细胞PD模型Ca2+/CaMKⅡ转导与线粒体H2O2交互作用抑制mTOR通路导致凋亡发生研究
1 材料及方法
1.1 主要药品及试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 重组腺病毒的构建及感染
1.4 慢病毒shRNA克隆,扩增和感染
1.5 细胞活性分析
1.6 DAPI和TUNEL染色
1.7 细胞H2O2成像
1.8 细胞[Ca2+]i成像
1.9 免疫印迹(Western blot)分析
1.10 统计分析
2 结果
2.1 鱼藤酮诱导神经细胞凋亡关联[Ca2+]i升高
2.2 鱼藤酮通过Ca2+介导mTOR通路抑制引发神经细胞凋亡
2.3 鱼藤酮诱导神经细胞Ca2+依赖的CaMKⅡ磷酸化介导mTOR通路抑制和凋亡
2.4 鱼藤酮引发Ca2+-CaMKⅡ依赖性地诱导神经细胞H2O2过量产生
2.5 鱼藤酮诱导线粒体H2O2依赖性的[Ca2+]i升高激活CaMKⅡ致mTOR抑制及神经细胞凋亡
2.6 过表达mTOR、持续激活S6K1和下调4E-BP1表达降低鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高介导CaMKⅡ磷酸化和神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第九章 神经细胞PD模型自噬抑制涉及不依赖mTOR通路的AMPK激活机制
1 材料及方法
1.1 主要药品及试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 腺病毒的构建与感染细胞
1.4 细胞免疫荧光染色
1.5 MDC染色
1.6 GFP-LC3分析
1.7 免疫印迹(Western blot)分析
1.8 统计分析
2 结果
2.1 PD细胞模型中α-Synuclein增加和自噬抑制
2.2 PD细胞模型中AMPK激活关联mTOR信号通路和自噬抑制
3 讨论
参考文献
第十章 神经细胞PD模型中阻断的Ulk1-Beclin 1及Atg5-Atg12途径抑制自噬分子机理研究
1 材料及方法
1.1 主要药品及试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 构建Ulk1敲除的PC12细胞
1.4 mCherry-GFP-LC3分析
1.5 免疫印迹(Western blot)和Co-IP分析
1.6 统计分析
2 结果
2.1 PD细胞模型中Ulk1和Beclin 1活性抑制
2.2 PD细胞模型中Beclin 1释放/活化受阻
2.3 敲除Ulk1强化PD毒物引发的神经细胞Beclin 1活化受阻
2.4 PD细胞模型中Atg5-Atg12复合物形成受阻关联自噬抑制
3 讨论
参考文献
第十一章 白藜芦醇保护抗镉诱导神经细胞凋亡实验研究
1 材料及方法
1.1 主要药品和试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 细胞形态学观察和活性分析
1.4 DAPI和TUNEL染色
1.5 免疫印迹(Western blot)分析
1.6 统计分析
2 结果
2.1 白藜芦醇削弱镉诱导神经细胞活性下降和形态学变化
2.2 白藜芦醇抵抗镉诱导神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第十二章 白藜芦醇通过抑制mTORC1和mTORC2信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡分子机理研究
1 材料及方法
1.1 主要药品和试剂
1.2 实验动物
1.3 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.4 重组腺病毒的构建和细胞感染
1.5 慢病毒shRNA设计,构建和感染
1.6 细胞活性分析
1.7 TUNEL染色
1.8 免疫印迹(Western blot)分析
1.9 统计分析
2 结果
2.1 下调mTOR增强白藜芦醇抑制镉诱导神经细胞凋亡
2.2 mTORC1和mTORC2通路涉及白藜芦醇抗镉神经毒性发挥保护作用
2.3 白藜芦醇通过靶向mTORC1介导S6K1途径抗镉诱导神经细胞凋亡
2.4 白藜芦醇通过靶向mTORC1介导4E-BP1途径抗镉诱导神经细胞凋亡
2.5 白藜芦醇通过靶向mTORC2介导Akt途径抗镉诱导神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第十三章 白藜芦醇通过PP2A和PP5抑制镉激活Erk1/2和JNK通路抗神经细胞凋亡分子机理研究
1 材料及方法
1.1 主要药品和试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 重组腺病毒的构建和感染
1.4 台盼蓝染色活细胞分析
1.5 DAPI染色
1.6 免疫印迹(Western blot)分析
1.7 统计分析
2 结果
2.1 白藜芦醇通过阻滞镉激活JNK和Erk1/2通路抗神经细胞凋亡
2.2 钝化c-Jun或MKK1表达增强白藜芦醇抗镉诱导神经细胞凋亡
2.3 白藜芦醇营救Cd抑制的神经细胞PP2A和PP5活性
2.4 过表达PP2A提高白藜芦醇抑制镉诱导JNK、Erk1/2和p38激活和神经细胞凋亡
2.5 过表达PP5增强Res抑制Cd诱导JNK,Erk1/2活化及抗神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第三部分 全文结论
全文结论
附1 攻读博士学位期间研究成果及获奖情况
致谢
本文编号：3979131
【文章页数】：247 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
缩略词(Abbreviations)
摘要
Abstract
引言
第一部分 文献综述
第一章 神经细胞调亡及其相关神经变性疾病的研究现状
1 细胞凋亡的形态学特征
2 细胞凋亡的分子机制
3 细胞凋亡的生物学意义
4 细胞凋亡的检测方法
4.1 显微镜技术
4.2 TUNEL染色法
4.3 Hoechst和DAPI染色法
4.4 流式细胞分析法
4.5 Western Blotting检测
5 细胞凋亡与神经变性疾病的关系
6 小结
参考文献
第二章 神经变性疾病体内体外模型研究进展
1 帕金森病模型诱导剂概述
1.1 MPTP/MPP+
1.3 鱼藤酮(Rotenone)
2 体内、体外帕金森模型的建立
2.1 6-OHDA诱导的帕金森病模型
2.2 鱼藤酮诱导的帕金森病模型
2.3 MPTP/MPP+诱导的帕金森病模型
2.4 基因编辑技术产生PD动物模型
3 阿尔茨海默病模型诱导剂概述
3.1 OKA
3.2 Wortmannin
3.3 Isoprenaline
3.4 Haloperidol
3.5 Colchicine
4 经典的阿尔茨海默模型建立
5 其他神经变性疾病模型的建立
6 小结
参考文献
第三章 神经细胞ROS、Ca2+/CaMKⅡ-mTOR信号转导与凋亡/变性发生的关系
0 ROS调控机制及其稳态
1 神经细胞ROS与凋亡/变性的关系
1.1 神经细胞ROS与凋亡/变性同线粒体的关系
1.2 神经细胞ROS与凋亡/变性关联细胞毒性分子
1.3 神经细胞ROS与凋亡/变性关联调控蛋白Bcl-2
2 Ca2+/CaMKⅡmTOR的分子结构
2.1 Ca2+/CaMKⅡ的分子结构
2.2 mTOR的分子结构
3 Ca2+/CaMKⅡ-mTOR信号转导网络
4 Ca2+/CaMKⅡ-mTOR信号转导与凋亡/变性的关系
5 小结
参考文献
第四章 神经细胞Akt/AMPK-mTOR信号通路作用及与凋亡/变性发生的关系
1 Akt的分子结构
2 AMPK的分子结构
3 Akt/AMPK-mTOR信号通路
4 神经细胞Akt/AMPK-mTOR信号通路与凋亡/变性的关系
4.1 神经细胞Akt-mTOR信号与凋亡/变性
4.2 神经细胞AMPK-mTOR信号与凋亡/变性
5 小结
参考文献
第五章 神经细胞PP2A/PP5-MAPK信号转导及与凋亡/变性的关系
1 PP2A的分子结构
2 PP5的分子结构
3 MAPK的分子结构
4 神经细胞PP2A-MAPK信号与凋亡/变性
5 神经细胞PP5-MAPK信号与凋亡/变性
6 小结
参考文献
第六章 神经细胞自噬与凋亡关系在神经变性疾病发生中的作用
1 细胞自噬的概念和过程
1.1 细胞自噬的概念
1.2 细胞自噬的过程
2 神经细胞自噬与凋亡的关系
3 神经细胞的自噬和凋亡与帕金森病的关系
4 神经细胞的自噬和凋亡与阿尔兹海默病的关系
5 神经细胞的自噬和凋亡与亨廷顿舞蹈病的关系
6 神经细胞的自噬和凋亡与肌萎缩侧索硬化的关系
7 小结
参考文献
第二部分 实验研究
第七章 动物PD模型大脑SNC和海马回神经元凋亡与Akt/AMPK/mTOR活性关系研究
1 材料和方法
1.1 主要试剂及药品
1.2 实验动物来源及造模
1.3 样品采集和处理
1.4 脑切片免疫组化分析
1.5 免疫印迹(Western blot)分析
1.6 数据分析
2 结果
2.1 MPTP诱导小鼠大脑SNc区的TH+细胞数目减少
2.2 MPTP诱导小鼠大脑SNc区神经元凋亡
2.3 鱼藤酮诱导大鼠大脑脑SNc及海马回神经元凋亡
2.4 鱼藤酮诱导大鼠纹状体AMPK/Akt/mTOR信号通路异常涉及凋亡
3 讨论
参考文献
第八章 神经细胞PD模型Ca2+/CaMKⅡ转导与线粒体H2O2交互作用抑制mTOR通路导致凋亡发生研究
1 材料及方法
1.1 主要药品及试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 重组腺病毒的构建及感染
1.4 慢病毒shRNA克隆,扩增和感染
1.5 细胞活性分析
1.6 DAPI和TUNEL染色
1.7 细胞H2O2成像
1.8 细胞[Ca2+]i成像
1.9 免疫印迹(Western blot)分析
1.10 统计分析
2 结果
2.1 鱼藤酮诱导神经细胞凋亡关联[Ca2+]i升高
2.2 鱼藤酮通过Ca2+介导mTOR通路抑制引发神经细胞凋亡
2.3 鱼藤酮诱导神经细胞Ca2+依赖的CaMKⅡ磷酸化介导mTOR通路抑制和凋亡
2.4 鱼藤酮引发Ca2+-CaMKⅡ依赖性地诱导神经细胞H2O2过量产生
2.5 鱼藤酮诱导线粒体H2O2依赖性的[Ca2+]i升高激活CaMKⅡ致mTOR抑制及神经细胞凋亡
2.6 过表达mTOR、持续激活S6K1和下调4E-BP1表达降低鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高介导CaMKⅡ磷酸化和神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第九章 神经细胞PD模型自噬抑制涉及不依赖mTOR通路的AMPK激活机制
1 材料及方法
1.1 主要药品及试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 腺病毒的构建与感染细胞
1.4 细胞免疫荧光染色
1.5 MDC染色
1.6 GFP-LC3分析
1.7 免疫印迹(Western blot)分析
1.8 统计分析
2 结果
2.1 PD细胞模型中α-Synuclein增加和自噬抑制
2.2 PD细胞模型中AMPK激活关联mTOR信号通路和自噬抑制
3 讨论
参考文献
第十章 神经细胞PD模型中阻断的Ulk1-Beclin 1及Atg5-Atg12途径抑制自噬分子机理研究
1 材料及方法
1.1 主要药品及试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 构建Ulk1敲除的PC12细胞
1.4 mCherry-GFP-LC3分析
1.5 免疫印迹(Western blot)和Co-IP分析
1.6 统计分析
2 结果
2.1 PD细胞模型中Ulk1和Beclin 1活性抑制
2.2 PD细胞模型中Beclin 1释放/活化受阻
2.3 敲除Ulk1强化PD毒物引发的神经细胞Beclin 1活化受阻
2.4 PD细胞模型中Atg5-Atg12复合物形成受阻关联自噬抑制
3 讨论
参考文献
第十一章 白藜芦醇保护抗镉诱导神经细胞凋亡实验研究
1 材料及方法
1.1 主要药品和试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 细胞形态学观察和活性分析
1.4 DAPI和TUNEL染色
1.5 免疫印迹(Western blot)分析
1.6 统计分析
2 结果
2.1 白藜芦醇削弱镉诱导神经细胞活性下降和形态学变化
2.2 白藜芦醇抵抗镉诱导神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第十二章 白藜芦醇通过抑制mTORC1和mTORC2信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡分子机理研究
1 材料及方法
1.1 主要药品和试剂
1.2 实验动物
1.3 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.4 重组腺病毒的构建和细胞感染
1.5 慢病毒shRNA设计,构建和感染
1.6 细胞活性分析
1.7 TUNEL染色
1.8 免疫印迹(Western blot)分析
1.9 统计分析
2 结果
2.1 下调mTOR增强白藜芦醇抑制镉诱导神经细胞凋亡
2.2 mTORC1和mTORC2通路涉及白藜芦醇抗镉神经毒性发挥保护作用
2.3 白藜芦醇通过靶向mTORC1介导S6K1途径抗镉诱导神经细胞凋亡
2.4 白藜芦醇通过靶向mTORC1介导4E-BP1途径抗镉诱导神经细胞凋亡
2.5 白藜芦醇通过靶向mTORC2介导Akt途径抗镉诱导神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第十三章 白藜芦醇通过PP2A和PP5抑制镉激活Erk1/2和JNK通路抗神经细胞凋亡分子机理研究
1 材料及方法
1.1 主要药品和试剂
1.2 PC12细胞系及原代小鼠皮质神经元培养
1.3 重组腺病毒的构建和感染
1.4 台盼蓝染色活细胞分析
1.5 DAPI染色
1.6 免疫印迹(Western blot)分析
1.7 统计分析
2 结果
2.1 白藜芦醇通过阻滞镉激活JNK和Erk1/2通路抗神经细胞凋亡
2.2 钝化c-Jun或MKK1表达增强白藜芦醇抗镉诱导神经细胞凋亡
2.3 白藜芦醇营救Cd抑制的神经细胞PP2A和PP5活性
2.4 过表达PP2A提高白藜芦醇抑制镉诱导JNK、Erk1/2和p38激活和神经细胞凋亡
2.5 过表达PP5增强Res抑制Cd诱导JNK,Erk1/2活化及抗神经细胞凋亡
3 讨论
参考文献
第三部分 全文结论
全文结论
附1 攻读博士学位期间研究成果及获奖情况
致谢
本文编号：3979131
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