骨骼肌细胞再生在mdx小鼠中的研究
发布时间：2017-06-06 20:28
本文关键词：骨骼肌细胞再生在mdx小鼠中的研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的:杜兴型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是肌纤维膜抗肌萎缩蛋白(dystrophin)完全缺失导致的一种进行性肌营养不良,为进行性肌营养不良中发病率最高的类型之一。该病一种X连锁隐性遗传的致死性肌病。其主要表现为缓慢进行性加重的对称性肌无力和萎缩,首发症状为骨盆带肌肌群无力,腓肠肌假性肥大。经大量研究,有多种病理生理机制参与了疾病的形成与发展,如氧化应激、炎症反应、自噬凋亡、细胞内钙超载等。无论哪一种改变均可引起肌细胞的变性坏死,如何修复变性坏死的肌细胞,促进肌细胞再生,恢复肌肉组织的功能成为我们研究的重点。mdx小鼠是目前研究肌营养不良的经典模型,与DMD患者一样,mdx小鼠骨骼肌细胞膜上不表达dystrophin蛋白。mdx小鼠的组织学在早期是正常的,在3周左右出现肌细胞变性坏死,表现出肌无力症状,随着疾病发展,肌细胞再生占据主导地位,病情趋于平稳,无力症状得到改善。而DMD患者肌细胞再生并不明显,无力症状逐渐加重,最终失去行走能力,甚至死亡。DMD患者与mdx小鼠发病机制均为骨骼肌细胞膜上dystrophin蛋白缺失,但mdx小鼠的临床表现要比人类轻很多,mdx小鼠肌力低下轻度的原因可能是肌细胞再生对坏死过程的代偿良好所致,可见肌细胞再生在改善症状,延缓病情进展方面起到了举足轻重的作用。骨骼肌再生是机体为了维持内环境稳态以及生长发育所必需的生理过程。再生过程涉及:骨骼肌细胞变性坏死,炎症反应的激活,炎症细胞因子的释放,静止的肌卫星细胞的激活,成肌细胞增殖分化形成成熟肌纤维。而肌卫星细胞是参与肌细胞再生的重要细胞类型,这些细胞在激活之后能够增殖分化成新的肌纤维,是动物出生后骨骼肌生长和肌再生的主要细胞来源。本研究旨在观察DMD患者与mdx小鼠肌肉组织病理学差异,研究mdx小鼠骨骼肌细胞再生相关基因在不同时期的差异性表达,以及神经细胞抑制生长因子(Necdin)和脑表达X-连锁蛋白1(bex1)基因在mdx小鼠及对照鼠中的表达,探讨Necdin、bex1与mdx小鼠肌细胞再生的相关性。为进一步探讨肌卫星细胞的激活因子相关基因对肌营养不良患者治疗的可行性提供理论依据。方法:实验分为两部分:实验一,观察DMD患者及mdx小鼠与对照鼠的肌肉组织在病理组织学上的特征。实验二,探索肌再生相关基因在mdx小鼠不同时期的差异性表达。实验一:选取DMD患者及正常人,各三例。所有受试者均经光镜、电镜检查后确诊。每位受试者均签署了知情同意书,并对肱二头肌或股四头肌或腓肠肌行开放式肌活检。受试者的活检肌肉均进行常规组织学和免疫组织学染色。选取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju小鼠为实验鼠,根据肌肉组织病理学变化分为2周组、4周组、8周组、12周组。选取雄性C57BL/6Sc Sn小鼠为对照鼠,同样分为2周组、4周组、8周组、12周组,每组各3只。以10%水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉,取小鼠双侧股四头肌,进行常规组织学染色。实验二:实验鼠与对照鼠的选取、分组及取材同上,每组各3只,分别用于基因表达谱研究及q RT-PCR检测。利用基因芯片技术观察肌再生相关基因在mdx小鼠不同时期的差异性表达,并通过q RT-PCR技术探索mdx小鼠与对照鼠不同时期Necdin、bex1基因的表达情况。并应用spss13.0进行统计学分析。结果:1 DMD患者肌肉组织的病理学特征。通过常规染色观察症状早期及终末期的DMD患者的组织病理学变化。症状早期的患者可见肌纤维大小不等,基本呈圆形外观,可见肌纤维变性、坏死、再生,炎症细胞浸润。终末期患者可见肌肉组织中结缔组织和脂肪组织明显增生,仅残存少量肌纤维。免疫组织化学染色显示DMD患者Dystrophin蛋白在肌纤维膜上完全缺失。2 mdx小鼠肌肉组织不同时期的病理学特征。通过常规染色动态观察mdx小鼠及对照鼠不同时期的的组织病理学变化。2周:mdx小鼠肌肉组织开始出现散在肌纤维的变性坏死及炎症细胞的浸润。同龄对照鼠基本没有肌纤维的坏死。4周:mdx小鼠出现大量肌纤维的变性及成群肌纤维的坏死,同时伴有较多炎症细胞的浸润,可见散在以中心核、嗜碱性胞浆为特征的再生肌纤维。同龄正常对照小鼠无上述病理改变。8周:再生肌纤维成群存在,坏死肌纤维散在分布。同龄正常对照小鼠未见明显再生肌纤维。12周:绝大多数肌细胞具有多个核,且细胞核逐渐向肌膜周边分布,肌细胞趋于成熟。同龄正常对照小鼠无上述病理改变。3基因芯片结果(1)聚类分析结果将对mdx小鼠4组样本得到的差异基因进行聚类分析,聚类分析后得到聚类热图,每组mdx小鼠样本均聚类在一起。其中2周组与12周组相比较差异表达基因较明显。(2)基因筛选结果对2周与12周mdx小鼠股四头肌组织的基因检测结果进行比较,取P"f0.05,Fould-Change"g+2,Fould-Change"f㧟2为筛选基因的条件,差异表达基因共2928个,与肌细胞再生相关的基因约有368个,表达上调的基因有271个,表达下调的基因有97个。部分差异基因见表1。其中Necdin基因Fould-Change=10.1611,bex1基因Fould-Change=-2.87293。4 Necdin、bex1基因在mdx小鼠及对照鼠骨骼肌细胞中不同时期的表达。通过q RT-PCR发现,Necdin与bex1存在于正常小鼠的骨骼肌细胞中。与对照组相比,mdx小鼠4周组和8周组股四头肌中Necdin及bex1基因表达量升高,mdx2周组表达量降低,差异均有统计学意义(P0.05)。在mdx小鼠自身对照中,8周组股四头肌中Necdin与bex1基因表达含量最高,与其他组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。在正常对照小鼠的自身对照中,2周组股四头肌Necdin与bex1基因表达含量最高,与其他组相比,差异有统计学意义(P0.05),且随着时间延长表达量逐渐降低。结论:1通过DMD患者与mdx小鼠的肌肉组织病理学观察,DMD患者的肌纤维的再生远不如mdx小鼠明显。2参与调控mdx小鼠肌细胞再生的基因很多。Necdin与bex1存在于正常小鼠的骨骼肌细胞中,且在小鼠生长发育的早期阶段含量较高。Necdin与bex1在促进mdx小鼠肌细胞分化过程中起到一定作用。Necdin与bex1可能通过激活肌卫星细胞促进肌细胞再生。
【关键词】：骨骼肌细胞再生 mdx小鼠 基因表达谱 Necdin bex1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R746.2
【目录】：
- 中文摘要4-8
- 英文摘要8-13
- 英文缩写13-14
- 前言14-15
- 材料与方法15-22
- 结果22-24
- 附图24-30
- 附表30-33
- 讨论33-37
- 结论37
- 参考文献37-42
- 综述 调节骨骼肌细胞再生的细胞因子研究进展42-53
- 参考文献47-53
- 致谢53-54
- 个人简历54
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