miR-29s表达异常减少对胶质瘤迁移侵袭的作用及其机制的研究

发布时间：2017-06-07 04:07

  本文关键词：miR-29s表达异常减少对胶质瘤迁移侵袭的作用及其机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】miR-29家族成员miR-29a、b和c(miR-29s)是一组重要的抑瘤微小RNA(TS-miRNA),其表达异常降低与多种恶性肿瘤的迁移侵袭密切相关。细胞分裂周期蛋白42(CDC42)在多种颅内、外恶性肿瘤细胞中过表达,研究显示其可通过调控细胞骨架重排和细胞运动,直接参与肿瘤细胞的浸润性生长。在前期研究中,我们已证实miR-29s在胶质瘤细胞中普遍低表达,且其表达水平随肿瘤良恶性级别的升高而进行性降低;荧光素酶实验亦证实CDC42是miR-29s的天然靶基因。但是,miR-29s表达异常是否是胶质瘤胞获得活跃迁移侵袭能力的重要原因,CDC42及其下游相关通路是否是miR-29s易化胶质瘤侵袭迁移的关键靶点和关键效应通路,目前仍不清楚。本研究即对上述问题进行深入探讨。【方法】⑴以人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251MG为研究对象,利用脂质体分别转染miR-29a、b、c mimics和无义对照序列(Scr),建立miR-29a/b/c转染组和Scr组,同时以未转染的细胞系作为空白对照组(Mock);利用stem-loop qRT-PCR检测各组miR-29a/b/c的表达水平;通过体外迁移侵袭实验观察miR-29a/b/c对胶质瘤细胞侵袭迁移的影响。⑵利用qRT-PCR和Western blot观察miR-29a/b/c对CDC42 mRNA和蛋白表达水平的影响,明确其与胶质瘤细胞迁移侵袭能力之间的关系。⑶通过转染miR-29a、b、c mimics等量混合物(miR-29mimics mix)构建miR-29s转染组,共转染miR-29 mimics mix和CDC42过表达质粒p-CDC42构建miR-29s+CDC42转染组,共转染CDC42特异性siRNA和p-CDC42构建siRNA+CDC42转染组,以Mock及Scr转染组为对照,对比各组CDC42的表达水平及其迁移侵袭能力;⑷观察上述各组肿瘤细胞内磷酸化PAK1/2/3、LIMK1/2及cofilin(p-PAK1/2/3、p-LIMK1/2及p-cofilin)含量的变化,明确敲低内源性CDC42表达及补充外源性CDC42对PAK/LIMK/cofilin通路生物学活性的影响,明确其与胶质瘤细胞侵袭迁移能力的关系。【研究结果】⑴与Mock和Scr组相比,miR29a/b/c转染组miR-29a/b/c含量明显升高,而迁移侵袭细胞数明显降低,证实miR-29a/b/c能有效抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭能力。⑵与Mock和Scr组相比,miR29a/b/c转染组CDC42 mRNA及蛋白表达水平均明显降低,证实miR-29a/b/c可以诱导CDC42 mRNA的降解并阻断其编码蛋白的表达。⑶miR-29 mimics mix及CDC42特异性siRNA均可有效敲低CDC42蛋白的表达水平,并模拟miR-29a/b/c对U87-和U251MG细胞迁移侵袭的抑制作用,而经质粒转染外源性CDC42可有效逆转miR-29 mimics mix及C DC42特异性siRNA的上述抑瘤效应,进一步证实CDC42是miR-29s抑制胶质瘤侵润性生长的关键靶点,并提示CDC42异常过表达可能是导致胶质瘤细胞获得活跃迁移侵袭能力的重要原因。⑷miR-29 mimics mix及CDC42特异性siRNA转染均可使U87-/U251MG细胞系p-PAK1/2/3、p-LIMK1/2和p-cofilin含量明显低于相应Mock及Scr组,而转染外源性CDC42可逆转上述干预因素对PAK、LIMK及cofilin磷酸化的影响;鉴于磷酸化对cofilin F-肌动蛋白解聚酶活性的抑制作用及其在肿瘤细胞片状伪足形成和迁移过程中的重要作用,上述结果证实PAK/LIMK/cofilin是CDC42调节胶质瘤细胞迁移侵袭能力的重要效应通路,而miR-29s通过敲低CDC42蛋白的表达、下调PAK/LIMK/cofilin通路的生物活性发挥抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的作用。【结论】⑴miR-29a,b及c(miR-29s)可有效抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭,miR-29s异常低表达是胶质瘤细胞获得活跃迁移侵袭能力的重要分子机制。⑵在胶质瘤细胞中CDC42是miR-29s的天然靶基因,miR-29s可通过降解其mRNA特异性地抑制CDC42蛋白的表达。⑶CDC42是调节胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的重要因子,也是miR-29s抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭的关键靶点。⑷PAK/LIMK/cofilin是C DC42调节细胞运动及肿瘤细胞迁移侵袭的关键效应通路,CDC42通过该通路诱导cofilin磷酸化,从而起到促进胶质瘤细胞迁移侵袭的作用。⑸miR-29s通过敲低胶质瘤细胞CDC42的表达抑制PAK/LIMK/cofilin通路的生物活性,这是其抑制胶质瘤迁移、侵袭重要分子机制。⑹本研究结果提示,CDC42及其下游PAK/LIMK/cofilin通路可作为阻遏胶质瘤侵袭性生长的关键靶点和靶通路,而miR-29s可作为潜在干预因子用于恶性胶质瘤的基因干预及分子靶向治疗。
【关键词】：胶质瘤 miR-29 细胞分裂周期蛋白42 迁移 侵袭
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 材料与方法15-26
• 1. 主要实验仪器15
• 2. 实验材料15-16
• 2.1 人胶质瘤细胞系和培养基15
• 2.2 mimics、siRN A及qRT-PCR检测试剂盒15-16
• 2.3 Western blot试剂盒16
• 2.4 其它重要试剂16
• 3. 实验方法16-26
• 3.1 miR-29a/b/c转染及转染效率的鉴定16-19
• 3.2 miR-29a/b/c对胶质瘤细胞侵袭迁移影响的检测19-20
• 3.3 miR-29a/b/c对CDC42表达水平影响的检测20-24
• 3.4 外源性CDC42对miR-29抑制胶质瘤迁移侵袭的干预实验24
• 3.5 CDC42特异性siRN A对抑制胶质瘤细胞迁移侵袭影响的检测24-25
• 3.6 敲低CDC42对PAK、LIMK和cofilin磷酸化影响的检测25
• 3.7 统计学方法25-26
• 结果26-45
• 1. 转染mimics可有效提高胶质瘤细胞miR-29a/b/c的含量26-27
• 2. miR-29a/b/c抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭27-29
• 3.miR-29a/b/c敲低胶质瘤细胞CDC42的表达29-31
• 4. 外源性CDC42可逆转miR-29s对迁移侵袭的抑制作用31-35
• 5. CDC42逆转siRNA对胶质瘤细胞迁移侵袭的抑制作用35-38
• 6. miR-29s和siRN A可降低PAK、LIMK、cofilin蛋白的磷酸化38-45
• 讨论45-50
• 结论50-51
• 参考文献51-57
• 发表论文和参加科研情况说明57-58
• 综述 CDC42下游靶基因和生物学功能58-72
• 综述参考文献67-72
• 致谢72

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