microRNA-155靶向PICALM抑制肠道病毒71型在神经细胞中的复制

发布时间：2017-06-19 19:02

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【摘要】：目的:肠道病毒71型(EV71)属微小RNA病毒科肠道病毒属A组,是引起手足口病的主要病原体之一。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的单链非编码小分子RNA,miRNA不编码蛋白,而是通过与mRNA的3'端非编码区或编码区的结合位点结合,降解或者抑制mRNA的翻译来抑制基因的表达。在EV71感染神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)miRNA差异表达谱的实验基础上,利用miRNA(模拟体)mimic和miRNA(抑制体)inhibitor筛选并验证了对EV71有调控作用的miRNA-155(miR-155),并进一步阐明了miR-155通过靶向PICALM抑制EV71在神经细胞中的复制。方法:(1)收集感染EV71前后的SK-N-SH神经细胞,提取总RNA,利用miRNA芯片得出EV71感染SK-N-SH前后差异miRNA表达谱,筛选EV71感染SK-N-SH前后显著差异的miRNA;并利用实时荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)验证芯片结果。(2)利用miRNA mimic和miRNA inhibitor转染SK-N-SH神经细胞,改变miRNA水平,利用细胞病变效应(CPE)观察、病毒滴度TCID50测定、QRT-PCR、Western blotting(WB)等方法,与阴性对照组和空白对照组比较EV71病毒复制的变化,验证mi RNA对EV71在SK-N-SH神经细胞中复制的调控作用。(3)利用miRNA的靶基因数据库mi Randa,TargetScan和miRbase,筛选miRNA的靶基因,双荧光素报告酶法验证miRNA的靶基因。利用靶基因的过表达载体和小干扰RNA(si-RNA)分别上调和下调靶基因的表达后,观察miRNA对EV71调控作用的变化,验证miRNA通过靶向基因调控EV71在神经细胞中的复制。结果:(1)在EV71感染SK-N-SH神经细胞后,mi RNA芯片和qRT-PCR结果均显示miRNA-155的表达水平显著上升,且mi R-155的上升与EV71病毒的感染量、感染时间均呈正相关。(2)mi RNA-155 mimic转染SK-N-SH神经细胞后,miR-155水平显著上升,与阴性对照相比,EV71在SK-N-SH神经细胞中的复制被抑制。同时,miR-155对EV71病毒复制的抑制作用与miR-155的表达水平呈正相关。(3)利用miRBase等生物学软件并结合基因功能,筛选出miR-155的候选靶基因PICALM。在EV71病毒感染SK-N-SH神经细胞后,PICALM基因的蛋白水平明显下降。利用PICALM的过表达载体和siRNA分别上调和下调该基因表达,结果显示,过表达PICALM基因能够减少miR-155对EV71的抑制作用,而下调PICALM基因的表达能够进一步抑制EV71的复制。结论:本研究发现miR-155通过靶向PICALM抑制EV71在SK-N-SH神经细胞中的复制。
【关键词】：miR-155 EV71 PICALM SK-N-SH神经细胞
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 绪论13-30
• 1.1 肠道病毒71型13-18
• 1.1.1 概述13-14
• 1.1.2 EV71复制与感染14-15
• 1.1.3 EV71的致病机理15-16
• 1.1.4 EV71感染的相关疾病16
• 1.1.5 EV71流行概况16-17
• 1.1.6 EV71的实验室诊断和治疗17-18
• 1.2 微小RNA（MIRNA）18-20
• 1.2.1 概述18
• 1.2.2 成熟miRNA的生物合成18-19
• 1.2.3 成熟miRNA的作用机制19-20
• 1.3 MIRNA与EV71的相互作用20-26
• 1.3.1 概述20-21
• 1.3.2 miRNA与EV71的相互作用21-24
• 1.3.3 EV71与其它肠道病毒的作用24-26
• 1.4 磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白(PICALM)26-27
• 1.4.1 概述26
• 1.4.2 PICALM在病毒感染过程中的作用26-27
• 1.5 研究目的，方法，实验设计方案和意义27-30
• 1.5.1 研究目的27
• 1.5.2 研究方法27-29
• 1.5.3 研究意义29-30
• 第二章 EV71感染SK-N-SH神经细胞引起MIR-155的水平上升30-42
• 2.1 实验仪器及材料30-34
• 2.1.1 主要试剂30-32
• 2.1.2 实验仪器32-33
• 2.1.3 实验材料33
• 2.1.4 主要溶液配制33-34
• 2.2 实验方法34-38
• 2.2.1 细胞培养34-35
• 2.2.2 EV71传代35
• 2.2.3 EV71滴度TCID50检测35-36
• 2.2.4 miRNA基因芯片36
• 2.2.5 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）验证miRNA基因芯片结果36-38
• 2.2.6 统计学分析38
• 2.3 实验结果38-42
• 2.3.1 miRNA表达谱差异分析38-39
• 2.3.2 QRT-PCR验证EV71感染前后miR-155的表达39-40
• 2.3.3 miR-155的表达水平与EV71感染时间呈正相关40-41
• 2.3.4 miR-155的表达水平与EV71感染滴度呈正相关41-42
• 第三章 MIR-155能抑制EV71在神经细胞SK-N-SH中的复制42-53
• 3.1 实验仪器及材料42
• 3.2 实验方法42-47
• 3.2.1 细胞培养42
• 3.2.2 miRNA的转染42-43
• 3.2.3 miRNA转染效率的测定43
• 3.2.4 QRT-PCR检测miRNA抑制EV71病毒核酸43-44
• 3.2.5 Western blot检测miRNA抑制EV71复制的能力44-46
• 3.2.6 统计学分析46-47
• 3.3.实验结果47-53
• 3.3.1 miR-155 mimic转染SK-N-SH神经细胞后引起miR-155水平升高47-48
• 3.3.2 miR-155减缓了细胞的病变效应（CPE）48-49
• 3.3.3 miR-155降低了EV71的病毒滴度49-50
• 3.3.4 miR-155抑制EV71核酸的复制50-51
• 3.3.5 miR-155抑制EV71 VP1蛋白的表达51-53
• 第四章 MIR-155通过靶向PICALM抑制EV71的复制53-76
• 4.1 实验仪器及材料53
• 4.2 实验方法53-63
• 4.2.1 细胞培养53
• 4.2.2 miRNA的转染53
• 4.2.3 相关质粒图谱53-54
• 4.2.4 miR-155与PICALM靶向关系的验证54-62
• 4.2.5 PICALM过表达质粒的构建62
• 4.2.6 PICALM干扰基因的验证62-63
• 4.2.7 QRT-PCR检测PICALM mRNA的表达63
• 4.2.8 Western blotting检测PICALM蛋白的表达63
• 4.2.9 QRT-PCR检测EV71 mRNA的表达63
• 4.2.10 Western blotting检测EV71蛋白的表达63
• 4.2.11 统计学分析63
• 4.3 实验结果63-76
• 4.3.1 miR-155靶基因PICALM的验证63-65
• 4.3.2 EV71感染后，PICALM蛋白水平下降65-66
• 4.3.3 PICALM下调抑制EV71的复制66-70
• 4.3.4 miR-155通过靶向PICALM抑制EV71的复制70-73
• 4.3.5 讨论73-76
• 第五章 结论及展望76-77
• 5.1 结论76
• 5.2 展望76-77
• 参考文献77-86
• 致谢86-88
• 攻读硕士学位期间发表的文章88-89

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1 吴静;microRNA-155靶向PICALM抑制肠道病毒71型在神经细胞中的复制[D];江苏大学;2016年

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本文编号：463418