miR-223-3p通过靶向作用STMN1调控胶质瘤细胞的生长和替莫唑胺化疗敏感性

发布时间：2017-06-23 16:08

  本文关键词：miR-223-3p通过靶向作用STMN1调控胶质瘤细胞的生长和替莫唑胺化疗敏感性，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脑胶质瘤是恶性程度和侵袭性最高的中枢神经肿瘤之一,约占了所有原发性脑胶质瘤的35-60%。尽管采用标准的治疗方式-手术切除后辅以同期联合放化疗,脑胶质瘤的预后效果依然较差,病人的中位生存期只有约14.6个月,是五年生存率最低的肿瘤之一。脑胶质瘤病人预后不良极大程度上是由于肿瘤的快速生长,高度侵袭性和复发率。替莫唑胺(TMZ)可使得DNA甲基化的抗肿瘤药物并且易于通过血脑屏障,被公认为是一种对脑胶质瘤有良好效果的化疗药。TMZ能抑制肿瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡,予以联合放疗和TMZ化疗有利于胶质瘤患者提高总体存活率。然而,TMZ的化疗耐药性被认为是联合放化疗效果最主要的问题。STMN1 (Stathmin)是分子量约为19kDa的胞质蛋白,它通过阻止微管蛋白的聚合或促进微管的解聚作用和突变来调控细胞微管蛋白动态,从而影响有丝分裂纺锤体的形成,通过抑制STMN1的表达,可以干扰恶性肿瘤细胞的有丝分裂,从而影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。据文献报道,肿瘤中STMN1蛋白的表达水平与患者的预后效果相关,即STMN1表达水平越高,患者的存活率越低,并且肿瘤的转移风险也越高。研究表明,STMN1高表达于恶性肿瘤中,并且STMN1的表达水平与癌细胞的增殖、侵袭和转移密切相关。越来越多的证据表明STMN1涉及了肿瘤的化疗耐药性。本课题组发现STMN1的表达在TMZ耐药胶质瘤细胞U87TR中显著高于亲本细胞U87。因此,就STMN1可能与脑胶质瘤耐药的相关性做深入探讨。MicroRNAs(miRNA)是一类只有18～22个碱基长度的非编码小分子RNA,它是通过转录后抑制或者降解相应的mRNA来调控特异性的靶蛋白发挥作用。miRNA在肿瘤发生发展中起着重要的作用,如：肿瘤的增殖、侵袭、转移和化疗耐药等。通过生物信息学技术分析,我们发现STMN1可能是miR-223-3的潜在靶点。miR-223-3p最初被研究证实是一个造血系统的调控因子,后被证实在多种肿瘤中呈异常表达。根据迄今报告的证据,明确的了miR-223-3p对不同的细胞过程产生重要的影响,鉴于其对细胞功能的调控作用,如增殖、迁移、化疗敏感性等,miR-223-3p可能具有改变肿瘤细胞的表型的潜能,但其中的一些重要的分子机制尚未明确,还需要更深入的研究。因此,本研究目的是为了探讨STMN1对胶质瘤的增殖、侵袭、转移和耐药等生物特性的影响,并且是否通过miR-223-3p靶向调控,为胶质瘤的靶向治疗提供新的思路。本课题组在成功构建TMZ化疗耐药的胶质瘤细胞株U87TR的基础上,利用qRT-PCR和Western blot技术对胶质瘤细胞株U87TR检测STMN1基因和miR-223-3p的表达水平,并检测脑胶质瘤临床病例肿瘤组织标本中STMN1与miR-223-3p的表达情况,分析两者的关联性；利用双荧光素酶检测系统分析miR-223-3p与STMN1之间的调控关系,在分子水平上验证了STMN1是miR-223-3p可能的靶向调控基因,通过在胶质瘤细胞系U87中过表达miR-223-3p,验证miR-223-3p是否对胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力产生作用和是否与胶质瘤对TMZ化疗耐药的作用；通过在胶质瘤细胞系U251中干扰STMN1的表达,探讨STMN1与胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力及TMZ化疗敏感性的关系,明确miR-223-3p对STMN1潜在的调控作用。本研究分为三个部分：1.TMZ耐药的胶质瘤细胞株和胶质瘤组织标本中STMN1和miR-223-3p的表达目的：检测TMZ耐药胶质瘤细胞株U87TR及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤(WHO分级)中STMN1的表达,明确STMN1是否与脑胶质瘤恶性程度及TMZ化疗耐药相关。方法：渐次倍增提高亲本胶质瘤细胞U87培养基中TMZ的药物浓度构建TMZ耐药细胞株U87TR,采用CCK-8试剂盒检测U87TR细胞对不同浓度TMZ的存活率、qRT-PCR和Western blot检测耐药相关基因的表达进行其生物学特性鉴定；qRT-PCR和Western blot检测STMN1在耐药细胞U87TR中的表达,qRT-PCR检测miR-223-3p耐药细胞U87TR中的表达；收集珠江医院神经外科和南方医院神经外科各级别胶质瘤组织标本(n=31),通过qRT-PCR检测正常脑组织(n=7)和胶质瘤组织标本的STMN1的表达,免疫组化分析胶质瘤组织STMN1的表达。采用qRT-PCR检测正常脑组织(n=7)、Ⅰ-1Ⅱ级(n=10)、Ⅲ级(n=11)和Ⅳ级(n=10)胶质瘤(WHO分级)中miR-223-3p的表达,Pearson相关分析miR-223-3p与STMN1在胶质瘤中的相关性。结果：成功构建TMZ耐药细胞株U87TR,相关耐药基因MDR1、BCRP和MRP的mRNA和蛋白在U87TR中的表达较亲本细胞U87显著上调,U87TR细胞株中STMN1表达水平较亲本细胞U87明显升高；胶质瘤组织中miR-223-3p的表达随胶质瘤恶性程度增高显著降低,并且miR223-3p在TMZ耐药细胞株U87TR细胞中的表达比亲本U87细胞明显降低；qRT-PCR及免疫组化结果显示级别越高的胶质瘤组织STMN1的表达量越高；Pearson相关分析显示miR-223-3p与STMN1在胶质瘤中呈负相关。结论：STMN1和miR-223-3p参与胶质瘤的耐药调节机制,并与胶质瘤的恶性程度存在相关性。2.胶质瘤细胞中miR-223-3p调控STMN1的表达目的：明确胶质瘤中STMN1是否为miR-223-3p直接的靶点基因。方法：运用生物信息学技术预测分析miR-223-3p在STMN13'UTR端的结合位点；双荧光素酶报告基因系统验证miR-223-3p对STMN1表达的调控影响；采用化学合成核苷酸miR-223-3p mim、NC (miRNA mimics negative control)、 miR-223-3p NC inhibitor和miR-223-3p inhibitor脂质体转染U251和U87胶质瘤细胞；qRT-PCR和Western blot检测U251和U87细胞中STMN1 mRNA和蛋白水平,分析miR-223-3p对STMN1的影响。结果：胶质瘤细胞中STMN1基因mRNA的3'UTR是miR-223-3p的直接调控靶点；胶质瘤细胞U87和U251中miR-223-3p对STMN1的表达有负调控作用。结论：STMN1是miR-223-3p的直接靶点基因。3.miR-223-3p通过靶向作用STMN1调控胶质瘤细胞生长和耐药性目的：明确miR-223-3p靶向作用STMN1对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力及TMZ化疗敏感性的影响。方法：应用化学合成核苷酸miR-223-3p mimics、NC (miRNA mimics negative control)脂质体介导转染人胶质瘤细胞系U87; qRT-PCR和Western blot检测miR-223-3p对STMN1的mRNA和蛋白质的表达的影响,CCK8检测miR-223-3p对胶质瘤细胞增殖的作用；药物敏感试验检测miR-223-3p对胶质瘤细胞的对TMZ耐药性的影响；Transwell模型检测miR-223-3p对胶质瘤细胞侵袭和转移的作用；人工体外合成siRNA-STMN1小干扰RNA经脂质体介导转染人胶质瘤U251; qRT-PCR和Western blot检测siRNA-STMN1对STMN1基因的mRNA和蛋白质的干扰效率；CCK-8检测siRNA-STMN1对胶质瘤细胞增殖能力的作用；药物敏感试验检测siRNA-STMN1对胶质瘤细胞的对TMZ化疗耐药性的影响；Transwell模型检测siRNA-STMN1对胶质瘤细胞侵袭和转移能力的作用。结果：miR-223-3p mimics转染后U87细胞的STMN1 mRNA和蛋白水平明显下调,siRNA-STMN1转染后的U251的STMN1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低,siRNA-STMN1对STMN1的干扰效率达约30%；与NC组相比,miR-223-3p mimics组细胞增殖的数量明显下降,侵袭和迁移的细胞数量也显著减少,并且miR-223-3p mimics组细胞对TMZ的IC50值明显降低；与siRNA-NC组相比,siRNA-STMN1可减少细胞增殖、侵袭和迁移的数量,并降低对TMZ的IC。结论：miR-223-3p靶向STMN1调控胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和TMZ敏感性。
【关键词】：胶质瘤 STMN1 miR-223-3p 化疗敏感性
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 中文摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-18
• 参考文献15-18
• 第一部分 替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞株和胶质瘤组织标本中STMN1和miR-223-3p的表达18-46
• 一. 引言18-19
• 二. 材料与方法19-38
• 三. 结果38-42
• 四. 讨论42-43
• 五. 结论43
• 参考文献43-46
• 第二部分 胶质瘤细胞中miR-223-3p调控STMN1的表达46-69
• 一. 引言46-47
• 二. 材料与方法47-49
• 三. 实验方法49-62
• 四. 结果62-66
• 五. 讨论66-67
• 六. 结论67
• 参考文献67-69
• 第三部分 miR-223-3p通过靶向作用STMN1来调控胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性69-89
• 一. 引言69-70
• 二. 材料与方法70-80
• 三. 结果80-84
• 四. 讨论84-85
• 五. 结论85
• 参考文献85-89
• 全文小结89-91
• 综述91-95
• 参考文献93-95
• 英文缩略词对照表95-96
• 学习期间发表论文96-97
• 致谢97-98

【共引文献】

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本文编号：475575