白藜芦醇对鱼藤酮致神经元氧化损伤的保护作用及分子机制研究

发布时间：2017-06-27 01:00

  本文关键词：白藜芦醇对鱼藤酮致神经元氧化损伤的保护作用及分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是常见于中老年人的运动障碍性疾病,也是仅次于阿尔茨海症的第二大慢性神经退行性疾病,该病的主要病理学特点是黑质内多巴胺能神经元大量变性丢失,并形成以a-突触核蛋白、泛素、神经丝蛋白为主的Lewy、体。据统计,65岁以上人群中PD的发病率高达1.7%。随着我国人口老龄化的加剧,PD的患病率逐年增加,严重威胁着中老年人的身心健康。因此,阐明PD的发病机制是迫切需要解决的问题。诸多的研究已证实家族性PD与遗传因素有关,但90%的散发性PD的病因不清,尤其是黑质多巴胺神经元的特异性退变至今未能完全解释。早在上世纪90年代,因吸食含有N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的海洛因,吸食者出现典型的PD症状,并且外源性MPTP可在灵长类动物中复制出PD的动物模型。由此,环境因素逐渐成为PD研究关注的焦点。流行病学调查显示,长期接触杀虫剂和除草剂显著增加PD的患病风险。鱼藤酮是从植物毛鱼藤中提取而来的广泛应用于农业中的杀虫剂,与1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP+)结构类似,均有联吡啶结构。研究发现,鱼藤酮可抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性,降低ATP合成,并诱导神经细胞线粒体内活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)积聚,进而导致线粒体氧化损伤,最终触发细胞凋亡。给予鱼藤酮处理的小鼠,不仅诱发类似PD的症状表现,还选择性导致黑质多巴胺神经元数目减少。临床研究也证实,PD患者脂质过氧化物、DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷显著升高。同时,机体氧自由基清除系统谷胱甘肽减少,过氧化氢酶活性下降,提示氧化应激介导了PD神经元凋亡。尽管上述研究表明鱼藤酮参与了PD的氧化应激,但具体鱼藤酮导致神经氧化损伤的分子机制还需要进一步的阐明。白藜芦醇是一种存在于葡萄、花生红衣中的多酚类天然化合物,是植物抵御外界侵袭的抗毒素。近年来,因其广泛的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及神经保护等作用,尤其是其抗氧化应激的突出功效日益受到人们的关注。已有学者研究发现,白藜芦醇可改善PD模型鼠的行为学改变,并增加纹状体组织抗氧化酶活性。白藜芦醇是沉默信号调控因子1(silence signal regulation fator1, SIRT1)最强的激活剂。SIRT1也是最先发现Sirtuin家族成员。通过去乙酰化作用,SIRT1可调控多种转录因子活性及蛋白质修饰,从而参与细胞代谢、衰老及发育等一系列生理及病理过程。以往的研究报道,SIRT1可减少氧化应激而保护血管功能,并能升高过氧化氢酶活性。过表达SIRT1显著提高神经元对氧自由基毒性损伤的耐受力。作为SIRT1的下游分子靶点,丝／苏氨酸蛋白激酶Akt1可被SIRT1去乙酰化激活为p-Akt1,与氧化应激、细胞凋亡及蛋白合成等密切相关,已有学者研究发现PD患者p-Akt1的活性降低。但SIRT1/Akt1信号通路是否介导了白藜芦醇拮抗鱼藤酮诱导的神经氧化损伤作用尚不清楚。基于上述背景,我们设计了本课题,旨在深入探讨鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的分子机制,观察白藜芦醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤是否具有保护作用,并分析SIRT1和Akt1在白藜芦醇发挥神经保护中的作用。首先,我们建立了鱼藤酮损伤的细胞模型。给予不同浓度的鱼藤酮损伤PC12细胞后观察形态变化,通过CCK8、LDH检测分析细胞活性变化,发现暴露在不同浓度的鱼藤酮中,细胞会出现不同程度的损伤,细胞活性下降,且呈剂量依赖性。其次,在鱼藤酮毁损PC12细胞24小时之前给予不同浓度的白藜芦醇进行预保护,检测细胞形态和细胞活性变化,结果显示,白藜芦醇可抑制鱼藤酮诱导的细胞损伤。经不同浓度的白藜芦醇预保护PC12细胞2小时之后,细胞形态发生了不同变化,随着浓度的升高细胞活性增强, 其中以251μM白藜芦醇保护效果最明显,较损伤组轴突变长,胞体变圆,细胞活性升高,而100μM的高浓度白藜芦醇没有保护效果,且加重了细胞损伤。然后,我们应用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐DCFH-DA检测、JC-1染色和Hoechst 33342/碘化丙啶(PI)双染技术分别检测细胞内活性氧ROS水平、线粒体膜电位的变化和细胞凋亡情况。结果发现,白藜芦醇抑制鱼藤酮诱导的氧化损伤、并增强线粒体功能及抑制细胞凋亡。和鱼藤酮损伤组比较,给予25μM的白藜芦醇2小时预保护后,细胞凋亡率和死亡率明显下降,细胞内生成ROS减少,以及线粒体膜电位升高。为进一步探讨其中的分子机制接下来采用Real-timePCR和Western Blotting检测了PC12细胞内SIRT1和Akt1的mRNA表达量以及蛋白表达量。发现和对照组比较,在鱼藤酮损伤组检测到SIRT1和Akt1的mRNA的表达量下降,SIRT1、p-Aktl的蛋白表达量下降,25μM白藜芦醇预保护PC12细胞能够部分逆转这种下降。最后,在白藜芦醇保护组中给予SDRT1的特异性抑制剂尼克酰胺,Akt1的抑制剂LY294002和MK-2206分别阻断SIRT1/Aktl的表达,以进一步明确SIRT1/Aktl信号通路是否参与了白藜芦醇的对抗鱼藤酮损伤PC12细胞的作用。应用SIRT1的特异性抑制剂,尼克酰胺抑制其生物活性,结果显示PC12细胞活性下降,白藜芦醇保护PC12的作用下降,SIRT1和p-Akt1蛋白表达均降低；然后给予Akt1的特异性抑制剂LY294002,抑制Akt1活性,同样CCK8显示细胞活性下降,SIRT1和p-Akt1蛋白表达降低。并且用Akt1的另一新型特异性抑制剂MK-2206结果同LY294402一致。分别加入阻断剂之后,尼克酰胺降低了SIRT1在蛋白和mRNA水平的表达,而LY294002和MK-2206作为Akt1的阻断剂不仅阻断了Akt1的激活也降低了SIRT1的表达,这表明SIRT1和Akt1之间可能存在着相互调节的关系。综上所述,本项研究结果表明,鱼藤酮可诱导神经元ROS产生、线粒体功能损伤,进而导致神经细胞凋亡；白藜芦醇可通过抗氧化应激拮抗鱼藤酮导致的神经元毒性损伤,其机制可能是通过增强SIRT1/Aktl分子通路的表达起到神经保护作用。
【关键词】：鱼藤酮 白藜芦醇 线粒体 SIRT1 Akt1
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符号说明12-13
• 前言13-16
• 实验材料16-20
• 实验方法20-28
• 结果28-33
• 讨论33-38
• 结论38-39
• 附图表39-50
• 参考文献50-54
• 致谢54-55
• 硕士期间发表论文情况55-56
• 附件56

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 胡道德;顾磊;刘皋林;;反相高效液相色谱法测定毛鱼藤中鱼藤酮的含量[J];药学实践杂志;2007年03期

2 邓宝;王彦永;王铭维;;鱼藤酮与帕金森病动物模型[J];脑与神经疾病杂志;2006年02期

3 刘红;葛晓群;;鱼藤酮与帕金森病动物模型的研究进展[J];中药药理与临床;2006年05期

4 卢海英;梁敬钰;陈燕;张欢;;毛鱼藤根中的鱼藤酮类成分Ⅰ[J];中国药科大学学报;2008年02期

5 唐金沙;金郁;王静;;反相高效液相色谱法测定紫穗槐中的鱼藤酮[J];大连民族学院学报;2008年03期

6 吴国炉;常春艳;高沛业;杨玲;左O;刘雯;;伊拉地平对鱼藤酮引起的神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用[J];中国临床神经科学;2013年01期

7 顾立祥;;口服鱼藤精致死一例[J];浙江医学;1992年04期

8 吴艳芬;王永春;苏军红;张延平;王伟;;鱼藤酮对大鼠脑内多巴胺能神经元损伤的机制研究[J];脑与神经疾病杂志;2014年02期

9 李云鹏,董兆君,王仕丽,蔡颖,李奇慧,乐卫东;重复注射鱼藤酮对中枢多巴胺神经元的毒性作用[J];第三军医大学学报;2003年13期

10 刘力;顾平;王铭维;;鱼藤酮对中脑多巴胺能神经元毒性机制的探讨[J];毒理学杂志;2005年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 ;鱼藤酮多巴胺能神经细胞早期凋亡模型的建立[A];湖北省暨武汉市病理生理学会第十二届学术年会论文汇编[C];2004年

2 徐丽;孙圣刚;;鱼藤酮诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

3 杨文杰;周利娟;徐汉虹;黄继光;;两种鱼藤植物中的鱼藤酮含量测定和鱼藤酮结晶比较[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年

4 叶姣;胡艾希;;鱼藤酮衍生物的合成与生物活性研究[A];2011年全国药物化学学术会议——药物的源头创新论文摘要集[C];2011年

5 刘佳;徐一娇;任倩;叶杨晶;陈素娟;郭敏;桂琳;周谦;高伟;陈龙;;鱼藤酮通过抑制mTOR信号通路诱导神经细胞死亡研究[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年

6 叶姣;陈晓东;胡艾希;;新型鱼藤酮衍生物的合成与抗肿瘤活性[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年

7 黄晓峰;尹文;王爽;李永强;亢君君;;鱼藤酮通过线粒体氧化应激途径诱导多巴胺能神经元凋亡[A];中国活性氧生物学效应学术会议论文集（第一册）[C];2011年

8 张庭英;徐汉虹;曾东强;李有志;安玉兴;;广西自治区鱼藤资源植物调查及其品质研究[A];第二十一届全国农药械“双交会”论文集[C];2005年

9 黄金莎;王涛;曹学兵;郝丽君;熊念;孙圣刚;;干扰GAPDH的过表达对PC12细胞的保护作用及机制[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

10 刘岩;孙建栋;苑玉和;陈乃宏;;鱼藤酮接触式给药致小鼠帕金森氏病模型的建立[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师（学术）论坛论文汇编[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 本报记者杨乐 通讯员林仁恭;南宁科技迈出国际合作步伐[N];南宁日报;2012年

2 徐铮奎;鱼藤酮与帕金森病[N];中国医药报;2001年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 吴锋;α-突触核蛋白自噬性降解障碍在环境毒素鱼藤酮导致帕金森症中机制研究[D];苏州大学;2015年

2 贾文婷;迷迭香酸对鱼藤酮诱导的帕金森病模型的保护作用及机制研究[D];青岛大学;2015年

3 胡文思;鱼藤酮对肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其诱导凋亡机制的研究[D];山东大学;2016年

4 陈晓东;鱼藤酮结构改造、类似物合成与生物活性研究[D];湖南大学;2013年

5 赛燕;多巴胺代谢功能障碍在鱼藤酮多巴胺神经元毒性中作用研究[D];第三军医大学;2006年

6 冯媛;鱼藤酮帕金森病模型中α-突触核蛋白聚集机制研究[D];华中科技大学;2007年

7 刘辉;鱼藤酮对星形胶质细胞谷氨酸转运系统的作用及其机制研究[D];第三军医大学;2007年

8 黄金莎;GAPDH过表达及异常聚集在帕金森病发病机制中作用的研究[D];华中科技大学;2009年

9 赵黔鲁;鱼藤酮损伤PC12细胞的机制研究[D];河北医科大学;2005年

10 韩威;鱼藤酮对PC12细胞毒性作用机制的蛋白质组学研究[D];吉林大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 白雪;线粒体铁蛋白保护由鱼藤酮引起的SH-SY5Y细胞损伤机制的研究[D];河北师范大学;2011年

2 孙洪祥;马齿苋酰胺E对帕金森病模型的保护作用研究[D];山东大学;2016年

3 王辉;白藜芦醇对鱼藤酮致神经元氧化损伤的保护作用及分子机制研究[D];山东大学;2016年

4 魏庆微;鱼藤酮对大鼠肾脏毒性及相关机制的研究[D];东北农业大学;2016年

5 谢益;鱼藤酮通过激活mTOR信号通路对小鼠巨噬细胞凋亡的影响以探讨对动脉粥样硬化的作用[D];南京中医药大学;2016年

6 王悦;鱼藤酮诱导多巴胺能神经细胞损伤的机制研究[D];中国协和医科大学;2007年

7 珠帕尔·木拉提;鱼藤酮对多巴胺能神经细胞损伤机制的研究[D];新疆医科大学;2004年

8 洪雨;硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成的调节及机制研究[D];苏州大学;2013年

9 贾凤菊;鱼藤酮对小鼠运动协调和空间学习记忆能力的影响[D];青岛大学;2014年

10 王超;鱼藤酮肟衍生物的合成、晶体结构、生物活性及理化性质[D];湖南大学;2009年

  本文关键词：白藜芦醇对鱼藤酮致神经元氧化损伤的保护作用及分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：488048