PPARγ保护原代皮层神经元过氧化氢损伤的研究

发布时间：2017-07-02 04:04

  本文关键词：PPARγ保护原代皮层神经元过氧化氢损伤的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:观察过氧化氢(H2O2)诱导的体外原代培养皮层神经元损伤中,过氧化物酶体增殖物激活受体g(PPARg)的表达及活性改变,以及PPARg激活或抑制对神经元过氧化氢损伤产生的影响,探讨PPARg对神经元氧化应激损伤的保护作用。实验方法:1、原代培养皮层神经元:取出生24h之内Sprague-Dawley新生鼠皮层神经元细胞进行体外原代培养,培养7天(d7)进行纯度鉴定,并用于各种处理和检测。2、神经元过氧化氢损伤模型:以不同浓度的过氧化氢作用于d7神经元,于不同作用时间后进行评价,选取合适浓度及作用时间应用于后续实验。3、细胞形态学观察:包括光镜下观察,即将不同组别细胞置于将倒置相差显微镜下,观察其形态变化,并采集图像;神经元MAP2免疫荧光染色,即用MAP2抗体标记神经元,荧光显微镜下观察不同组别细胞形态完整性的改变,并采集图像。4、MTT比色法检测细胞相对存活率,即检测不同组别神经元经处理后细胞活性的改变。5、分别提取总蛋白和核蛋白,Western blotting法检测不同组别细胞内PPARγ、p-PPARγ(磷酸化PPARγ)、p-ERK1/2(磷酸化ERK1/2,即ERK1/2的活性形式)、Bcl-2、活化的Caspase-3、Nrf2的表达水平。6、qRT-PCR法观察PPARγ靶基因:提取不同组别神经元RNA,qRT-PCR技术对PPARγ靶基因表达水平进行检测。7、ELISA法检测PPARγ-DNA结合活性:应用PPARγ转录因子分析试剂盒检测不同组别神经元PPARγ与过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)的结合活性。8、反义寡核苷酸法降低神经元PPARγ:用PPARγ反义寡核苷酸处理原代培养d7神经元细胞,抑制PPARγ表达。实验结果:1、体外培养正常皮层神经元2d后,大多细胞呈圆形或椭圆形,可见较细小的细胞突起,至第7天时神经元胞体立体感强,形态饱满,突起变长且增粗,并相互交织成网。用神经元特异性抗体微管相关蛋白2(MAP2)对进行免疫荧光染色,鉴定神经元阳性率达95%以上,是相对纯的神经元培养,可用于后续实验。2、将过氧化氢作用于神经元,可造成神经元损伤,轻者细胞肿胀变圆,细胞突起断裂或消失;重者细胞发生崩解,可见较多细胞碎片,并呈现剂量-时程依赖效应。选取浓度为500mM、作用6~24小时进行后续实验。3、过氧化氢抑制神经元PPARg蛋白表达,同时增加PPARg灭活;抑制ERK1/2激活可以拮抗过氧化氢对PPARg的灭活作用。4、外源性给予PPARg激动剂罗格列酮减轻神经元过氧化氢损伤、增加Bcl-2及Nrf2表达,同时抑制活化的Caspase-3表达;而PPARg抑制剂GW9662可以拮抗罗格列酮的保护作用、降低Bcl-2及Nrf2表达、增加活化的Caspase-3表达。5、降低PPARg表达,对正常基础状态下的神经元形态和存活率无明显影响,但使神经元对过氧化氢损伤更敏感,增加过氧化氢诱导的Bcl-2、Nrf2、活化的Caspase-3表达的改变,同时可以降低外源性给予PPARg激动剂罗格列酮所产生的保护作用。实验结论:1、在体外原代培养皮层神经元中,过氧化氢可能通过负性调节PPARg(即表达下调和活性降低)引起神经元损伤。2、在体外原代培养皮层神经元中,外源性激活PPARγ可以保护神经元过氧化氢损伤,而神经元自身PPARγ的表达可能是神经元自我保护机制之一。3、PPARγ的神经保护作用可能部分通过抑制活化的Caspase-3、上调Bcl-2抗凋亡蛋白,以及增加抗氧化应激转录因子Nrf2的表达实现的。
【关键词】：皮层神经元 过氧化氢 PPARγ 神经保护 氧化应激 Bcl2 Caspase-3 Nrf2
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符号说明10-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、过氧化氢损伤神经元中PPARγ表达及活性的研究16-36
• 1.1 对象和方法16-29
• 1.1.1 实验动物16
• 1.1.2 主要仪器设备16-17
• 1.1.3 实验试剂及耗材17-19
• 1.1.4 主要溶液及试剂配方19-22
• 1.1.5 实验方法22-29
• 1.1.6 统计学处理29
• 1.2 实验结果29-36
• 1.2.1 皮层神经元原代培养及过氧化氢损伤29-32
• 1.2.1.1 原代培养皮层神经元形态学观察及纯度鉴定29-31
• 1.2.1.2 过氧化氢损伤神经元形态学观察及细胞相对存活率评价31-32
• 1.2.2 过氧化氢抑制皮层神经元PPARγ 表达32-33
• 1.2.3 过氧化氢增加皮层神经元PPARγ 灭活33-34
• 1.2.3.1 过氧化氢增加磷酸化PPARγ（p-PPARγ）/PPARγ 比值33
• 1.2.3.2 ERK1/2 激活介导了过氧化氢诱导的PPARγ 灭活33-34
• 1.2.4 过氧化氢抑制神经元PPARγ 活性34-36
• 1.2.4.1 过氧化氢下调PPARγ 靶基因表达34
• 1.2.4.2 过氧化氢抑制神经元PPARγ-DNA结合活性34-36
• 二、PPARγ保护神经元过氧化氢损伤的研究36-48
• 2.1 对象和方法36-38
• 2.1.1 实验动物36
• 2.1.2 主要仪器设备36
• 2.1.3 实验试剂及耗材36
• 2.1.4 主要溶液及试剂配方36-37
• 2.1.5 实验方法37-38
• 2.1.6 统计学处理38
• 2.2 实验结果38-48
• 2.2.1 PPARγ 激动剂罗格列酮对皮层神经元过氧化氢损伤的保护作用38-40
• 2.2.1.1 细胞形态学观察38-39
• 2.2.1.2 细胞相对存活率评价39-40
• 2.2.1.3 Bcl-2、Caspase-3、Nrf2蛋白表达40
• 2.2.2 PPARγ 拮抗剂GW9662抑制罗格列酮对神经元过氧化氢损伤的保护作用40-43
• 2.2.2.1 细胞形态学观察40-41
• 2.2.2.2 细胞相对存活率评价41-42
• 2.2.2.3 Bcl-2、Caspase-3、Nrf2蛋白表达42-43
• 2.2.3 抑制PPARγ 增加皮层神经元对过氧化氢损伤的敏感性43-48
• 2.2.3.1 PPARγ 反义寡核苷酸抑制体外正常培养皮层神经元PPARγ 及其靶基因表达43-44
• 2.2.3.2 asON-PPARγ 加重神经元过氧化氢损伤44-45
• 2.2.3.3 asON-PPARγ 降低PPARγ 激动剂对神经元过氧化氢损伤的保护作用45-48
• 三、讨论48-55
• 3.1 过氧化氢对神经元细胞PPARγ 的负性调节作用48-50
• 3.2 神经元PPARγ 保护过氧化氢的细胞损伤作用50-55
• 结论55-56
• 参考文献56-68
• 发表论文和参加科研情况说明68-69
• 综述 ERK1/2 信号转导通路的作用69-80
• 综述参考文献74-80
• 致谢80

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