突变型低氧诱导因子1α修饰骨髓间充质干细胞对脑缺血性疾病的保护作用

发布时间：2017-07-14 04:05

  本文关键词：突变型低氧诱导因子1α修饰骨髓间充质干细胞对脑缺血性疾病的保护作用

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【摘要】：目的1、突变型低氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1,HIF1α)对脑缺血区血管新生、血液供应的恢复起到了积极而重要的作用。然而,在正常氧条件下,在低氧诱导因子1α的基因编码序列区(Coding s e q u e n c e,CDS)中,第564位点脯氨酸在脯氨酸羟化酶的作用下,很短时间内即被降解,第803位点天冬酰胺的转录活性被限制,从而抑制了HIF1α在正常氧条件下发挥其功能。因此,我们将HIF1α编码序列区中第564位点脯氨酸及第803位点天冬酰胺的密码子进行定点基因突变,分别构建在正常氧条件下及缺氧条件下能够稳定表达的突变型HIF1α重组腺病毒载体、在缺氧条件下能够稳定表达的野生型HIF1α重组腺病毒载体、及不含HIF1α基因的重组空腺病毒载体。2、取SD大鼠进行骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)培养,传代至第三代细胞待用。将成功构建的突变型低氧诱导因子1α重组腺病毒载体、野生型重组腺病毒载体及重组空腺病毒载体分别转染大鼠第三代骨髓间充质干细胞,按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)MOI=150进行转染。观察低氧诱导因子1α在BMSCs中m RNA及蛋白的表达情况是否有差异,能否阐明基因突变对HIF1α基因及蛋白表达产生的影响。将转染了三组重组腺病毒载体的BMSCs注射入经过脑缺血再灌注模型(Middle cerebral artery occlusion model,MCAO)的大鼠体内,通过免疫组织化学染色等结果判定突变型HIF1α能否为脑缺血性疾病的治疗带来新希望。方法在这项研究中,我们使用定向位点突变方法,将第564位点脯氨酸及第803位点天冬酰胺两个位点进行突变,获得HIF1α突变体,运用p Ad Easy-1腺病毒试剂盒构建突变型HIF1α腺病毒载体。将其用HEK293A细胞进行包装,大量扩增腺病毒,纯化后获得高滴度腺病毒,并将其按MOI=150转染至BMSCs中。RT-PCR及Western Blot检测在正常氧环境下HIF1α基因在大鼠间充质干细胞中m RNA及蛋白质的表达情况。为了检测突变型HIF1α重组腺病毒载体对脑缺血的治疗作用,我们将三种不同的重组腺病毒载体转染至BMSCs中,通过鼠尾静脉将转染后的BMSCs注射入经MCAO造模的大鼠体内。在MCAO造模后4周内,通过行为功能学测试(Modified neurological severity score,m NSS)及TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色,衡量大鼠的行为学损伤程度及脑梗死体积的大小。MCAO造模后第28天,采用Wertern Blot实验方法检测大鼠脑组织中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况。通过免疫组织化学染色方法评估脑梗死区的微血管密度及血管新生情况。结果1、定点突变第564位脯氨酸和第803位天冬酰胺的HIF1α重组腺病毒载体、野生型HIF1α重组腺病毒载体及空腺病毒载体构建成功。2、突变型HIF1α重组腺病毒载体、野生型HIF1α重组腺病毒载体、空腺病毒载体转染的BMSCs可见绿色荧光表达。3、RT-PCR结果表明:BMSCs组与空腺病毒组中细胞内HIF1α的m RNA表达量之间无统计学意义;HIF1α组与突变HIF1α组细胞内HIF1αm RNA表达量之间无明显差异;HIF1α组、突变HIF1α两组细胞内HIF1αm RNA表达量明显高于BMSCs组、空腺病毒两组,存在显著性差异(P0.05);Western blot检测结果表明:突变HIF1α组细胞的HIF1α蛋白表达量明显高于其他三组,存在显著性差异(P0.05);而其他三组之间HIF1α蛋白表达量差异均无统计学意义。4、行为学评分结果显示:从MCAO第7天开始,突变型HIF1α重组腺病毒载体组评分逐渐下降,而其他三组评分没有显著性差异;检测脑梗死体积结果显示:造模后第14天和第28天,突变型HIF1α重组腺病毒载体组脑梗死体积明显低于其他三组,而其他三组之间无显著性差异;免疫组织化学染色结果显示:在MCAO造模后的第7天开始,血管生成数量明显高于其他三组,而其他三组之间无显著性差异。结论成功构建能够在常氧条件下高效稳定表达的腺病载体,为脑缺血性疾病促血管新生治疗开辟了新途径。
【关键词】：突变型低氧诱导因子1α 脑缺血性疾病 大鼠骨髓间充质干细胞 血管新生
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 中文论著摘要4-7
• 英文论著摘要7-9
• 英文缩略语9-11
• 前言11-12
• 实验材料与方法12-24
• 结果24-32
• 讨论32-35
• 结论35-36
• 本研究创新性的自我评价36-37
• 参考文献37-48
• 附录48-65
• 一、文献综述48-62
• 参考文献51-62
• 二、在学期间科研成绩62-63
• 三、致谢63-64
• 四、个人简介64-65

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本文编号：539565