自噬对Hemin所致神经元损伤的作用及其相关机制研究

发布时间：2017-07-20 10:00

  本文关键词：自噬对Hemin所致神经元损伤的作用及其相关机制研究

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【摘要】：目的:脑出血后自噬激活对神经元损伤的影响尚不明晰,可能在某种特定条件下表现出促生存或促死亡的不同作用。本研究旨在以氯高铁血红素Hemin诱导的神经元细胞损伤作为脑出血体外模型,通过直接调节神经元细胞自噬水平,探究自噬对于的作用极其相关机制,并进一步探究脑出血条件下自噬与凋亡间的相互调节的关系。方法:运用原代细胞培养技术培养原代神经元细胞,以适量浓度的Hemin诱导神经元损伤作为脑出血的体外模型,利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)(10mM)及mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAP)(100nM)干预脑出血后神经元的自噬水平,使用荧光染料碘化丙啶(Propidium iodide,PI)标记死亡细胞并计算细胞死亡率,应用CCK-8试验检测细胞生存率,应用Western Blot(WB)半定量检测自噬相关蛋白:LC3,p62/SQSTM1(p62)及Beclin1的表达水平;以及凋亡相关蛋白:cleaved-Caspase3的表达水平。免疫荧光检测自噬、凋亡相关蛋白在神经元细胞原位表达的水平。结果:(1)经改进的小鼠脑皮质神经元的原代培养技术培养出的细胞生长状况良好,纯度高,过程简便,是神经科学研究中建立体外模型的好载体;神经元原代细胞培养成功后,经CCK-8实验评估细胞生存率和PI/MAP2评估神经元死亡率,确定Hemin剂量50μmol/L,给药6小时,可作为本研究中建立脑出血体外模型的给药方案。(2)PI染色结果显示:Hemin作用后神经元死亡数量增加,自噬抑制剂3-MA能够显著减少(p0.05)神经元死亡而自噬激动剂RAP能够显著增加(p0.01)神经元死亡率。(3)WB及免疫荧光结果显示:经自噬抑制剂3-MA预处理的神经元细胞自噬相关蛋白的表达水平显著降低(p0.05)而凋亡相关蛋白表达显著增加(p0.05);于此相对应的,经自噬激动剂RAP预处理的神经元细胞的自噬相关蛋白的表达水平显著增加(p0.05)而凋亡相关蛋白表达显著降低(p0.05)。结论:(1)经改进的小鼠脑皮质神经元的原代培养技术培养出的细胞生长状况良好,纯度高,过程简便,是神经科学研究中建立体外模型的好载体;(2)PI/MAP2评估神经元死亡率可消除原代神经细胞培养中非神经元细胞的干扰,Hemin剂量50μmol/L作用6小时,可作为建立小鼠脑出血体外模型的最佳策略;(3)促进自噬可增加Hemin所致神经元损伤,抑制自噬能够减少Hemin所致神经元损伤;(4)自噬对Hemin所致神经元损伤的保护作用与调节细胞凋亡通路有关。
【关键词】：自噬 凋亡 神经元细胞 脑出血
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.34
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 第一部分 小鼠脑皮质神经元细胞原代培养及体外脑出血模型的建立11-19
• 第一节 小鼠脑皮质神经元细胞的原代培养11-14
• 第二节体外脑出血模型的建立14-18
• 小结18-19
• 第二部分 自噬对Hemin诱导的神经元凋亡的影响19-39
• 第一节 自噬对于Hemin诱导的神经元损伤后的PI阳性细胞数量的影响19-22
• 第二节 3-MA对Hemin诱导的神经元损伤后自噬及凋亡相关蛋白表达的影响22-34
• 第三节 雷帕霉素对于Hemin诱导的神经元损伤后自噬及凋亡相关蛋白表达的影响34-38
• 小结38-39
• 讨论39-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 不足与展望48-49
• 综述49-57
• 参考文献54-57
• 中英文对照缩略词表57-58
• 攻读硕士期间公开发表的论文58-59
• 致谢59-60

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