缝隙连接Cx43在脑微血管痉挛中作用的体内实验研究

发布时间：2017-08-04 00:14

  本文关键词：缝隙连接Cx43在脑微血管痉挛中作用的体内实验研究

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【摘要】：目的缝隙连接(gap junction,GJ)在血管舒缩,尤其是在调节平滑肌方面发挥了重要作用,而缝隙连接蛋白(Cx)是缝隙连接发挥功能的基础。我们课题组重点在Cx43参与蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的研究中,前期研究表明,Cx43主要通过调节血管的收缩参与SAH后CVS的进展.但影像学上的CVS和延迟性缺血性神经功能障碍(DIND)临床表现并不完全相符,并且Cx43蛋白还广泛存在于微血管,故本研究假设SAH后微血管的痉挛与微血管中Cx43的表达密切相关。为验证假设,本实验通过使用二次注血的SAH大鼠模型,在动物体内研究Cx43的表达是否参与SAH微血管痉挛的调节及进一步深入了解其作用机制。方法1、二次注血的SAH模型建立:用普通级SD大鼠,行腹腔麻醉,尾静脉取血大概0.3ml备用,体式显微镜下枕大池穿刺,见有清亮脑脊液流出后,将尾静脉血注入,次日同时间点进行二次注血,从而完成造模过程。2、SD大鼠模型分组:正常组、SAH3天、7天组和腺病毒预处理的SAH3天、7天组。采用western blot、免疫组化检测各组大脑中动脉外侧裂向顶叶部延伸段末侧分支血管(直径20~80um)Cx43的表达水平变化;HE染色光镜下观察血管的收缩形态、内径变化、平滑肌细胞等相关病理变化。3、活体荧光显微镜检测:模型分组同上,通过尾静脉注入FITC-Dextran(标记血小板),采用活体荧光显微镜检测大脑中动脉分支微血管的直径变化,对比分析各组之间微血管的痉挛数量、痉挛程度。结果1、成功建立二次注血SAH模型,通过光镜观察提示大脑中动脉分支微血管管腔狭窄、增厚程度不同、内皮细胞水肿、变形,平滑肌细胞变性坏死,排列紊乱,平滑肌层增厚。2、Cx43的表达存在不同的变化,western blot检测SAH后Cx43表达量在持续增加,在7d时达到一个峰值。而加入腺病毒预处理组Cx43表达量相对于SAH组有下降。免疫组化提示SAH后在内皮、平滑肌、外膜层以看到明显的棕黄染色的Cx43阳性表达,而腺病毒预处理组同SAH组比较,Cx43阳性表达量有所下降。3、SAH组的血管痉挛数量和血管痉程度逐渐上升,在7day时达到高峰,腺病毒预处理组较SAH对照组血管痉挛数量和程度均有所下降。结论1、SAH后微动脉上Cx43表达量逐渐升高,在7天达到峰值。2、使用si RNA-Cx43腺病毒特异性下调Cx43表达能有效的减少微血管痉挛数量、缓解痉挛程度。3、SAH后直径越小的微动脉,血管痉挛收缩程度的越严重,随着时间的推移血管的痉挛程度加重,直径小的血管痉挛较直径大的血管痉挛加重程度更明显。
【关键词】：缝隙链接蛋白43 微循环 SAH 脑微血管痉挛 SiRNA
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.35
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英缩略词表9-10
• 第1章 前言10-13
• 第2章 材料与仪器13-17
• 2.1 实验动物13
• 2.2 实验试剂13-16
• 2.2.1 主要购置试剂13-14
• 2.2.2 主要试剂的配制14-16
• 2.3 实验仪器16-17
• 第3章 研究大鼠蛛网膜下腔出血后Cx43在大脑中动脉分支中的表达变化实验方法17-27
• 3.1 大鼠蛛网膜下腔出血模型的构建方法17
• 3.2 腺病毒给药方法、途径及剂量17
• 3.3 大鼠的大脑中动脉分支微血管标本的灌注固定17-18
• 3.4 HE染色观察蛛网膜下腔出血模型18-20
• 3.4.1 石蜡切片的制作18-19
• 3.4.2 HE染色法（苏木素－伊红染色）19-20
• 3.5 免疫组化观察大脑中动脉分支微血管Cx43的表达20-21
• 3.6 Western bolt检测大脑中动脉分支微血管的Cx43表达水平变化21-24
• 3.6.1 Western bolt检测腺病毒对Cx43的沉默效率21-24
• 3.6.2 Western bolt检测SAH后大脑中动脉分支微血管Cx43的表达变化24
• 3.6.3 Western bolt检测腺病毒预处理后SAH的大脑中动脉分支微血管Cx43的表达变化24
• 3.6.4 图像分析与数据统计分析24
• 3.7 体内实验的分组24-25
• 3.8 活体荧光显微镜测定25-26
• 3.8.1 活体荧光显微镜前期步骤25-26
• 3.8.2 图像测定采集方法26
• 3.9 数据统计分析26-27
• 第4章 实验结果27-35
• 4.1 HE染色观察大脑中动脉分支微血管的形态变化27
• 4.2 Western bolt检测腺病毒对Cx43的沉默效率检测结果27-30
• 4.2.1 Western bolt检测SAH和病毒预处理组大脑中动脉分支微血管Cx43的表达变化29-30
• 4.4 免疫组化的结果30-31
• 4.5 活体荧光显微镜结果31-35
• 4.5.1 血管痉挛数量31-32
• 4.5.2 血管痉挛程度32-33
• 4.5.3 不同直径的微动脉收缩程度33-35
• 第5章 讨论35-41
• 5.1 SAH、DIND与CVS35-36
• 5.2 脑微循环与DIND36-37
• 5.3 GJ与脑微循环37-38
• 5.4 缝隙连接蛋白Cx43与微血管收缩机制的探讨38-39
• 5.5 本实验研究结果的讨论39-41
• 第6章 结论与展望41-42
• 6.1 结论41
• 6.2 展望41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-47
• 附图47-49
• 综述49-57
• 参考文献55-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 臧小彪;张树龙;;缝隙连接蛋白40和心房颤动[J];心血管病学进展;2011年04期

2 陈红伟;洪涛;宋湖平;叶新运;汪阳;;缝隙连接蛋白43磷酸化在兔脑血管痉挛中的表达变化[J];重庆医学;2010年09期

3 洪涛,汪阳,蒋丽萍,高子云,辜斌,迟海波;缝隙连接阻断剂1-庚醇对脑血管痉挛的抑制作用[J];中华神经外科杂志;2005年04期

4 洪涛,高子云,蒋丽萍,汪阳;基底动脉缝隙连接蛋白的分布[J];江西医学院学报;2003年02期

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本文编号：616941