酸敏感钾离子通道TASK3在高钾神经元损伤中的作用及其一过性表达系统构建

发布时间：2017-08-10 03:16

  本文关键词：酸敏感钾离子通道TASK3在高钾神经元损伤中的作用及其一过性表达系统构建

  更多相关文章： 高钾损伤 TASK3 神经保护 缺氧缺血损伤 凋亡蛋白 转导肽 HIV-1反式激活因子 酸敏感钾离子通道-3 原核表达

【摘要】：急性缺氧缺血早期,神经细胞的膜通道功能和膜电位发生改变,胞内钠离子和钙离子浓度显著升高,胞外钾离子显著增加,引起细胞功能和结构发生改变,最终导致细胞死亡。酸敏感钾离子通道-3(TWIK-related acid-sensitive K+channel-3,TASK3)是双孔钾离子通道家族中较为特殊的一员,参与神经元凋亡调控过程。TASK3通道功能状态决定了细胞静息电位,并且控制神经元放电频率。在神经元缺氧损伤中,TASK3通过何种途径发挥其生理学功能鲜有报道。本研究旨在探究TASK3通道在高钾神经元损伤过程中作用,探讨在高钾损伤情况下TASK3通道活性对细胞凋亡的关系。此外,通过利用原核表达体系构建融合蛋白TASK3-Tat,借助Tat转导肽的穿透细胞膜的能力,构建TASK3蛋白一过性表达体系,为进一步研究TASK3在神经元高钾损伤或缺血损伤过程中发挥功能提供新的技术手段和科研思路。第一部分TASK3在高钾神经元损伤过程中的保护作用目的通过胞外高浓度钾溶液处理神经元细胞模拟机体缺血损伤,探究TASK3通道蛋白对高钾损伤神经细胞的作用。方法不同浓度钾溶液孵育SH-SY5Y细胞6h,倒置显微镜下观察不同处理组细胞形态变化,并CCK-8法检测细胞活力变化;采用CCK-8法分析不同浓度的TASK3激动剂氟烷和抑制剂精胺对高钾损伤后神经元细胞增殖的变化;通过Real-Time PCR和免疫印记手段检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 m RNA丰度及蛋白表达情况。结果给予细胞外不同浓度钾溶液处理后,发现胞外钾离子对神经元细胞活力的影响存在剂量性依赖和时间性依赖;添加不同浓度TASK3抑制剂精胺(50μM、100μM、500μM、1000μM)可显著降低SH-SY5Y细胞活力;而添加不同浓度TASK3激动剂氟烷(0.4m M、0.8m M、1.6m M、8m M)可显著增强细胞活力;在高钾损伤细胞模型中,精胺抑制TASK3通道活性后,Bax表达有所上调,Bcl-2/Bax比值明显降低,显示神经元细胞损伤加剧。而异氟烷增强该通道活性,下调Bax表达,Bcl-2/Bax比值明显升高,减缓神经元细胞的损伤。结论TASK3通道在高钾神经元损伤过程中发挥重要的神经保护作用。第二部分TASK3-Tat重组蛋白的构建及表达目的构建外源重组蛋白TASK3,借助转导肽Tat作用,透过细胞膜,发挥其神经保护作用。方法重组质粒p TASK3-GFP-Tat构建;利用Western Blot检测TASK3表达;利用Ni2+亲和层析柱和SDS-PAGE检测TASK3蛋白表达;荧光显微镜检测TASK3的转导作用及细胞定位。结果重组质粒p TASK3-GFP-Tat构建正确。纯化后的重组蛋白TASK3-GFP-Tat成功透过细胞膜转染神经细胞SH-SY5Y。结论重组蛋白TASK3在Tat转导肽介导作用下,透过细胞膜,成功建立了一过性表达重组蛋白TASK3的SH-SY5Y细胞株,为研究TASK3功能提供新的研究方法。
【关键词】：高钾损伤 TASK3 神经保护 缺氧缺血损伤 凋亡蛋白 转导肽 HIV-1反式激活因子 酸敏感钾离子通道-3 原核表达
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 第一部分 TASK3在高钾神经元损伤过程中的保护作用10-31
• 前言10-11
• 1 材料与方法11-21
• 2 结果21-26
• 3 讨论26-28
• 4 小结28-29
• 参考文献29-31
• 第二部分 TASK3-TAT重组蛋白的一过性表达构建31-51
• 前言31-32
• 1 材料与方法32-41
• 2 结果41-44
• 3 讨论44-47
• 4 小结47-48
• 参考文献48-51
• 综述：TASK3通道及其功能研究现状51-63
• 参考文献58-63
• 缩略语表63-64
• 攻读学位期间发表文章情况64-65
• 致谢65-66
• 个人简历66

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本文编号：648592