热休克蛋白70对缺血诱导嗜铬细胞瘤细胞膜钙通道影响的研究

发布时间：2017-08-10 03:30

  本文关键词：热休克蛋白70对缺血诱导嗜铬细胞瘤细胞膜钙通道影响的研究

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【摘要】：目的探讨慢病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤细胞(PC12)膜钙离子通道的影响及机制。方法构建表达外源性HSP70的重组慢病毒,感染对数生长期的PC12细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达HSP70的PC12细胞作为实验组,即重组慢病毒感染组[感染含HSP70及绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒]。同时设置慢病毒对照组[感染含GFP基因但不含HSP70基因的慢病毒]和未感染组(正常对照组)。以缺血/缺氧8h、复氧12h刺激PC12细胞模拟体内神经细胞遭受缺血/再灌注时的病理过程,采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测L型钙离子通道cav1.2、cav1.3亚基,受体门控通道基因NR1、NR2,以及Na+/Ca~(2+)交换体(NCX)的m RNA和蛋白表达。结果(1)经缺血缺氧再复氧处理后,重组慢病毒感染组细胞cav1.2、NR1、NR2的m RNA及蛋白表达均明显低于慢病毒对照组和未感染组[cav1.2 m RNA(A值):3.13±0.46比5.12±0.52、5.13±0.66,NR1 m RNA(A值):1.61±0.44比3.23±0.82、3.31±0.78,NR2 m RNA(A值):2.09±0.41比3.91±0.64、3.88±0.62,cav1.2蛋白(灰度值):2.82±0.39比3.98±0.23、3.96±0.24,NR1蛋白(灰度值):1.84±0.35比2.79±0.21、2.86±0.23,NR2蛋白(灰度值):0.87±0.24比1.57±0.31、1.33±0.44,均P0.01];而慢病毒对照组与未感染组之间细胞cav1.2、NR1、NR2的m RNA及蛋白表达差异均无统计学意义(均P0.01)。(2)未感染组、慢病毒对照组和重组慢病毒感染组之间细胞cav1.3、NCX的m RNA和蛋白表达差异均无统计学意义[cav1.3m RNA(A值):4.82±0.32、4.72±0.36、4.82±0.29,NCX m RNA(A值):3.49±0.78、3.47±0.71、3.56±0.65,cav1.3蛋白(灰度值):2.63±0.40、2.64±0.39、2.68±0.39,NCX蛋白(灰度值):3.27±0.48、3.34±0.48、3.31±0.42,均P0.01]。结论外源性HSP70对PC12细胞膜L型钙离子通道亚基cav1.2及受体门控通道基因的表达有显著影响,可能对缺血/缺氧引起的PC12细胞损伤具有保护作用。
【关键词】：热休克蛋白70 慢病毒 缺血缺氧 受体门控通道 L型钙离子通道
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第一章 材料与方法9-19
• 1 仪器、试剂和耗材9-11
• 1.1 主要设备和仪器9-10
• 1.2 试剂和耗材10
• 1.3 主要试剂配制10-11
• 2 实验方法11-18
• 2.1 PC12细胞的培养11-12
• 2.2 筛选细胞及分组12
• 2.3 缺血缺氧模型的建立12
• 2.4 PC12细胞中提取RNA12-13
• 2.5 PC12细胞蛋白质的提取13
• 2.6 PC12细胞外源性HSP70及其目的基因表达的检测13-18
• 2.6.1 RT-PCR检测HSP70及其目的基因的转录13-15
• 2.6.2 琼脂糖凝胶电泳15
• 2.6.3 三组m RNA表达量的比较15-16
• 2.6.4 Western Blot检测HSP70及其目的基因蛋白的表达16-17
• 2.6.5 三组蛋白表达量的比较17-18
• 3 统计学分析18-19
• 第二章 结果19-23
• 1 PC12细胞形态及慢病毒绿色荧光的观察19
• 2 PC12细胞中HSP70的表达19-20
• 3 PC12细胞中CAV1.2、CAV1.3、NCX、NR1、NR2的表达20-23
• 3.1 PC12细胞中cav1.2、cav1.3、NCX、NR1、NR2的转录20-21
• 3.2 PC12细胞中cav1.2、cav1.3、NCX、NR1、NR2的蛋白表达21-23
• 第三章 讨论23-28
• 1 热休克蛋白70的表达23
• 2 神经元缺血缺氧与热休克蛋白的表达23-24
• 3 PC12细胞和慢病毒载体的选择24-25
• 4 HSP70与钙超载25-26
• 5 研究展望26-28
• 结论28-29
• 参考文献29-33
• 综述33-45
• 参考文献41-45
• 攻读学位期间的研究成果45-46
• 致谢46-47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：648668