srGAP3在大脑皮层神经元MMDA兴奋毒性损伤中的作用

发布时间：2017-08-13 03:27

  本文关键词：srGAP3在大脑皮层神经元MMDA兴奋毒性损伤中的作用

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【摘要】：神经元兴奋毒性损伤学说是在1969年由Olney等人提出,用于阐述谷氨酸持续或过度刺激谷氨酸受体而导致神经元损伤或死亡的现象。近半个世纪来,大量的实验研究证明,兴奋毒性损伤学说是神经元损伤及神经系统疾病发生的重要机制之一,中枢神经系统创伤及多种神经元进行性退行疾病都存在兴奋毒性作用,包括中风、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、亨丁顿舞蹈症、癫痫等。它涉及的分子机制和信号通路十分复杂,目前比较明确的包括内质网应激,钙、钠、钾、氯等离子的异常动员,线粒体功能障碍,溶酶体不稳定,而上述这些事件的发生促发了自由基的大量生成、蛋白酶和蛋白激酶的激活、促死亡基因的表达,从而最终导致神经元以自噬、凋亡、坏死等不同形式结局。研究兴奋毒性损伤的发生机制是为了寻找可行的阻断策略和治疗手段,针对上述分子机制和信号通路的各类药物正被逐渐地研发,主要有谷氨酸受体的拮抗剂、谷氨酸释放的阻断剂、自由基清除剂及抗氧化剂、一氧化氮合酶抑制剂等。谷氨酸受体拮抗剂主要包括MK-801(Dizolcipine,地佐环平/地卓西平)、美金刚(Memantine)、NBQX等；谷氨酸释放阻断剂有BW619C89、利鲁唑等；自由基清除剂及抗氧化剂有α-苯基叔丁基硝酮N (PBN)、Tirilazad等；一氧化氮合酶抑制剂有7-硝基吲唑。但是,这众多的药物中,除了美金刚被批准应用于治疗中重度至重度阿尔茨海默型痴呆,利鲁唑被用于治疗肌萎缩侧索硬化症患者以外,其他药物或因为副作用过大、或因为临床试验疗效不明确、或因未能在中枢系统中起作用而停止在走向临床治疗的路上。截止目前,阻断神经元兴奋毒性发生、挽救神经元死亡的药物仍然匮乏,有待研发。Rho GTPase属于小G蛋白超家族的亚家族成员,其主要的成员包括：Rac1、 Cdc42、RhoA,它们存在于所有的真核细胞当中,并参与了广泛的信号转导途径,在调节肌动蛋白细胞骨架,调节细胞形态、粘附、迁移、侵袭、吞噬、细胞存活等过程中扮演着重要的角色。Rho GTPase在细胞内有两种状态,一种是与GTP结合的激活状态,一种是与GDP结合的失活状态。它们的激活和失活状态转换在细胞内受三类因子调控：鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)、GTP酶激活蛋白(GAPs)以及鸟嘌呤核苷酸交换因子抑制因子(GDIs)。GEFs催化RhoGTPase从GDP结合的失活状态变为GTP结合的激活状态；而GAPs则催化GTP水解,将Rho GTPase从GTP结合的激活状态变为GDP结合的失活状态；GDIs与失活状态的Rho GTPase结合,使其稳定于失活状态。研究表明,Rho GTPase参与调控神经细胞的存活。在大鼠的交感神经元中表达有活性的Rac1或Cdc42可以促进神经生长因子(NGF)因撤药引起的细胞凋亡,若过表达带突变结构域的(无活性)Rac1或Cdc42则可以阻断这种类型的细胞凋亡。Semenova等在2007年报道,RhoA在神经元兴奋毒性过程中活性显著升高,并介导随后的细胞死亡。这些研究从全细胞水平阐述了Rho GTPase在神经细胞存活过程中的作用,但Rho GTPase在亚细胞水平的激活变化情况及其对神经细胞存亡的作用仍有待研究。srGAPs,全称Slit-Robo GTP酶激活蛋白,是Rho GAPs的亚家族成员,是Robo受体的下游信号分子,它的主要成员包括srGAP 1、srGAP2、srGAP3。srGAPs在哺乳动物神经系统发育过程中起着十分重要的作用,介导轴突的生长方向和投射通路的形成,参与神经元芽生、神经细胞迁移和神经细胞分布。srGAP1的SH3结构域可与Robol的CC3结构域结合,使Rho GTPase家族的Cdc42失活,从而影响细胞骨架蛋白及引起肌动蛋白在细胞的不对称分布,最终引起神经细胞迁移和神经元轴突伸展方向变化。srGAP2的Rho GAP结构域可以促进有活性的Rac1水解失活,从而抑制神经元的迁移。srGAP3由F-BAR, GAP和SH3三个结构域组成。在小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞株,srGAP3通过F-BAR结构域附着在质膜上,及通过它的SH3结构域形成粘着斑。它的Rho GAP结构域可以抑制Rac1的活性,过表达srGAP3可以损伤肌动蛋白和微管活力,从而影响细胞突起的形成和细胞的粘附,使细胞变圆、伪足减少、迁移受损。srGAP3又被称为精神发育迟缓相关蛋白(Mental disorder-associated GAP protein, MEGAP),在精神发育迟缓3p综合征患者的中枢神经系统中,可以检测出srGAP3被破坏。srGAP3还可与Arp2/3激活蛋白Wave-1结合形成Wave-1/srGAP3复合物,参与海马神经元的树突棘发育、突触可塑性等过程并在长时程记忆形成过程中起着重要作用。srGAP3广泛表达于中枢神经系统不同的组织中,在大脑皮层呈高表达。近年来,srGAP3的其他功能在逐渐地被研究和认识。在人乳腺癌细胞株中过表达srGAP3,可使癌细胞增殖能力及侵袭能力降低；核定位的srGAP3可与核小体重塑复合物SWI/SNF重塑因子Brgl相互作用,可能参与了调控基因表达。在神经干细胞和神经祖细胞下调srGAP3的表达,可引起细胞凋亡。但srGAP3是否参与成熟神经元存活调控尚未清楚。我们感兴趣的问题是：srGAP3的表达水平在神经元兴奋毒性过程中是否发生变化?干扰它的表达水平是否能改变神经元存亡的结局呢?它在兴奋毒性过程中的下游信号分子是否为Rho GTPase呢?为了回答上述问题,我们首先在NMDA诱导的培养小鼠皮层神经元(12-15天)兴奋毒性模型上检测了NMDA处理后0h、1h、3h、6h时全细胞蛋白水平srGAP3的表达情况。结果发现NMDA处理后1h、3h、6h, srGAP3表达随时间逐渐下降。下一步,在培养小鼠皮层神经元,用靶向irGAP3基因的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体敲减srGAP3表达,检测其是否影响NMDA诱导的神经元死亡。结果发现慢病毒shRNA不引起正常神经元死亡,并且慢病毒shRNA敲减srGAP3表达对NMDA诱导的神经元死亡具有保护作用。srAP3在皮层神经元的胞浆和胞核均有表达,而上述研究结果表明,srGAP3在兴奋毒性发生过程中,全细胞的表达水平是呈下降趋势的,而用慢病毒shRNA进一步使其表达水平下降,它却表现出了神经元保护的作用。为了探明其中的分子机制,我们给予小鼠培养皮层神经元NMDA刺激后,分别于0h、 1h、3h、6h时提取胞浆和胞核蛋白,检测srGAP3的表达情况。结果发现在细胞浆,srGAP3的表达水平在1 h、3h和6h时,随时间显著下降,这与全细胞的表达水平趋势一致；而在细胞核,srGAP3的表达水平在0h、1h显著上升,3h和6h时表达水平与对照无差别。在兴奋毒性过程中,srGAP3在胞浆和胞核表达水平变化趋势的不一致这一结果提示srGAP3可能在这个过程中在胞浆和胞核扮演着不同的角色。然后,在培养小鼠皮层神经元,我们分别检测了Rho GTPase的三个主要成员Rac1、Cdc42、Rho A在NMDA处理后1h胞浆和胞核的激活水平,发现RhoA在胞浆的激活水平上升,而在胞核的激活水平下降；而Rac1和Cdc42的激活水平均无显著性改变,提示srGAP3可能通过调节RhoA的激活水平从而调控神经元存亡。于是,我们在慢病毒shRNA敲减srGAP3表达的条件下再给予NMDA处理后1h检测了RhoA的激活水平,结果发现它在胞浆的变化未受影响,而在胞核的失活被显著逆转。这一结果提示敲减srGAP3表达对兴奋毒性NMDA诱导的神经元死亡的保护作用可能是通过逆转胞核RhoA的失活,而NMDA导致的胞浆RhoA激活增加并非受到srGAP3的调控。我们已经证实,兴奋毒性发生时,srGAP3的表达水平在胞浆和胞核的变化趋势是不同的,并且在细胞核,慢病毒shRNA敲减srGAP3可以逆转兴奋毒性NMDA刺激引起的RhoA失活。那么,srGAP3在胞浆的下游信号分子又是什么呢?Akt,又称蛋白激酶B (PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞内促进细胞存活的重要信号分子。在一些神经元的损伤死亡或疾病发生过程中,Akt已被认为是一个可能的治疗靶点,并且,它在胞浆和胞核有着不同的信号分子调控机制。于是,我们在慢病毒shRNA敲减srGAP3表达的条件下,给予培养小鼠皮层神经元NMDA刺激后1h,分别检测Akt在胞浆、胞核的磷酸化水平。结果发现慢病毒阴性对照组Akt在胞浆的磷酸化水平降低,在胞核没有明显变化；慢病毒shRNA组,Akt在胞浆的磷酸化水平进一步降低,而胞核未见显著变化。结合我们前面的结果,提示srGAP3在细胞浆和细胞核分别调控不同的信号分子从而在细胞存亡中扮演不同角色,保持足够的细胞浆srGAP3水平可能对维持Akt激活而促进神经元存活十分重要,兴奋毒性NMDA引起的srGAP3表达降低可能通过抑制Akt激活而促进神经元死亡。为了获得更有力的证据,我们在活体动物进行了实验。用腺相关病毒携带shRNA敲减小鼠大脑皮层srGAP3的表达,再给予NMDA刺激,观察神经元死亡情况。结果发现敲减srGAP3表达对NMDA诱导的小鼠大脑皮层兴奋毒性损伤也有保护作用。综上所述,我们的研究首次证实srGAP3参与神经元兴奋毒性发生过程,shRNA敲减srGAP3表达在离体培养小鼠皮层神经元及在体动物均对神经元兴奋毒性损伤具有保护作用。srGAP3在细胞浆和细胞核分别调控不同的信号分子从而在细胞存亡中扮演不同角色,在胞浆,保持足够的srGAP3可能对维持Akt激活而促进神经元存活十分重要；在胞核,敲减srGAP3表达逆转兴奋毒性NMDA诱导的RhoA失活而产生神经元保护作用。我们的研究阐明了兴奋毒性学说新的分子信号机制,为神经保护治疗提供了新的理论、实验依据与治疗靶点。
【关键词】：srGAP3 兴奋毒性 RhoGTP酶 Akt
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-22
• 材料与方法22-38
• 1 实验材料22-28
• 2 实验方法28-37
• 3 统计学分析37-38
• 结果38-53
• 一、NMDA诱导的培养皮层神经元兴奋毒性过程中srGAP3全细胞蛋白水平下降38-39
• 二、慢病毒shRNA敲减srGAP3表达保护NMDA诱导的培养皮层神经元损伤39-42
• 三、NMDA诱导的培养皮层神经元兴奋毒性过程中srGAP3在胞浆表达水平下降,在胞核表达上升42-43
• 四、慢病毒shRNA敲减srGAP3表达逆转NMDA诱导的胞核RhoA失活43-48
• 五、慢病毒shRNA敲减srGAP3表达进一步促进NMDA诱导的胞浆Akt激活减少48-50
• 六、腺相关病毒shRNA敲减srGAP3表达减轻NMDA诱导的小鼠大脑皮层损伤50-53
• 讨论53-57
• 参考文献57-62
• 成果62-63
• 综述63-72
• 参考文献68-72
• 致谢72-74

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本文编号：665152