银杏内酯B和白果内酯对星形胶质细胞清除α-突触核蛋白作用的影响及机制

发布时间：2017-08-28 19:13

  本文关键词：银杏内酯B和白果内酯对星形胶质细胞清除α-突触核蛋白作用的影响及机制

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【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球第二大老化相关的神经退行性疾病,其主要病理特征为脑内黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元进行性丢失,纹状体DA含量显著降低,同时伴有神经元内路易小体(Lewy body,LB)沉积及路易神经突(Lewy neuritis)形成。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)是一种主要表达在中枢神经系统突触前膜的可溶性蛋白,生理功能包括参与调节DA生物合成与释放、调节突触可塑性、参与脂质代谢及发挥分子伴侣功能等。α-syn也是LB的主要结构成分,它的异常积聚与PD的发生发展密切相关。在PD进程中,α-syn单体异常积聚形成聚集体,沉积于神经元中发挥毒性作用,其中,A53T突变型α-syn更容易发生聚集。神经元可释放α-syn至胞外,被邻近的神经元或胶质细胞摄取,引起α-syn在脑内的传播,并诱发炎症、神经元退行性变等一系列病理反应。星形胶质细胞是脑内数量最多的细胞,对中枢神经系统(Central nervous system,CNS)发育、神经元营养、支持以及脑内微环境的维持发挥重要作用。近年来,星形胶质细胞的吞噬与清除功能逐渐受到重视。在帕金森病中,从神经元释放的α-syn进入突触间隙,可被星形胶质细胞吞噬并清除。因此,深入研究星形胶质细胞对α-syn的清除作用及其机制,调节其清除α-syn的能力,减少异常激活的星形胶质细胞病理反应,有助于阐明PD的病理过程并探索基于星形胶质细胞的PD治疗新策略。银杏内酯B(Ginkgolide B,GB)和白果内酯(Bilobalide,BB)是从银杏叶中提取的萜类化合物,具有抗炎、抗氧化、DNA损伤修复等功能,主要用于缺血性脑卒中等脑血管疾病的治疗。近年来,研究发现GB和BB对阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病具有神经保护作用。深入研究阐明GB和BB对星形胶质细胞清除α-syn功能的调节作用,将有利于进一步深化对GB和BB神经保护效应的药理作用新机制的认识。本文第一部分工作首先构建了野生型(Wide type,WT)和A53T突变型α-syn蛋白表达质粒p ET-28b(+)-WT和p ET-28b(+)-A53T,对α-syn进行蛋白表达与纯化,进一步利用单体制备α-syn聚集体,应用SH-SY5Y细胞观察其神经毒性作用,并发现GB和BB改善α-syn聚集体诱导的神经损伤,发挥直接的神经保护作用。在此基础上,第二部分工作培养小鼠中脑原代星形胶质细胞,给予α-syn单体和聚集体刺激,发现星形胶质细胞摄取并清除α-syn,进一步研究发现GB和BB通过增强星形胶质细胞自噬功能,促进α-syn的清除,并改善α-syn刺激的星形胶质细胞条件培养基引起的神经损伤,发挥间接的神经保护作用。本研究为将GB和BB发展成为PD等神经退行性疾病的神经保护剂累积了学术基础,为有效延缓PD的病理进程提供新的策略和思路。第一部分α-syn单体和聚集体制备及其神经毒性鉴定目的:制备WT和A53Tα-syn单体和聚集体,并鉴定其神经毒性。方法:构建WTα-syn和A53Tα-syn蛋白表达质粒p ET-28b(+)-WT及p ET-28b(+)-A53T并鉴定。将质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,通过煮沸、酸沉淀、硫酸铵沉淀方法进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,western blotting及MALDI蛋白质质谱分析进行蛋白鉴定。α-syn单体(1 mg/ml)溶于PBS,37℃,250 rpm振摇14天,短暂超声,制备WT/A53Tα-syn聚集体,通过western blotting、硫磺素T(Thioflavin T,Th T)结合实验以及电镜鉴定α-syn聚集体结构。SH-SY5Y细胞给予不同浓度的α-syn单体和聚集体刺激,MTT实验和LDH检测观察细胞损伤,流式细胞术及western blotting检测细胞凋亡。SH-SY5Y细胞预孵育GB和BB 2h后给予MPP+(200μM)和WTα-syn聚集体(1μM)刺激24h,MTT实验和LDH检测观察SH-SY5Y细胞活力,明场观察细胞形态,western blotting检测细胞Bcl-2/Bax蛋白水平。结果:1)BLAST序列比对显示,构建的p ET-28b(+)-WT蛋白表达质粒插入片段的碱基排列顺序与人源性SNCA一致,p ET-28b(+)-A53T插入片段相对于SNCA的第157个碱基由G突变为A;2)目的蛋白纯度均大于90%,western blotting及MALDI蛋白质质谱分析鉴定纯化获得的蛋白是α-syn蛋白;3)western blotting结果显示WT和A53Tα-syn蛋白聚集体在55~70 k D位置出现明显的目标条带;WT和A53Tα-syn聚集体Th T结合力相对于单体显著增加,A53Tα-syn较WTα-syn增加更明显;电镜下α-syn呈现聚集结构;4)WT和A53Tα-syn聚集体呈浓度依赖性引起SH-SY5Y细胞活力下降和LDH释放增加;α-syn聚集体显著增加SH-SY5Y的AnnexinⅤ/PI标记阳性细胞数,降低SH-SY5Y细胞Bcl2/Bax蛋白比例;5)GB和BB抑制MPP+及α-syn聚集体诱导的SH-SY5Y细胞活力下降和LDH释放增加,抑制α-syn聚集体引起的SH-SY5Y细胞形态改变和Bcl2/Bax比值下降。结论:1.WTα-syn和A53Tα-syn单体和聚集体制备成功。2.WTα-syn和A53Tα-syn聚集体具有神经毒性作用。3.GB和BB抑制α-syn诱导的细胞凋亡而发挥神经保护作用。第二部分银杏内酯B和白果内酯对星形胶质细胞清除α-syn作用的影响目的:研究GB和BB对星形胶质细胞清除α-syn作用的影响及机制。方法:培养小鼠原代中脑星形胶质细胞,免疫荧光观察GFAP阳性率。给予星形胶质细胞α-syn单体和聚集体刺激不同时间,western blotting方法检测细胞α-syn水平。FITC标记WTα-syn聚集体,给予星形胶质细胞刺激,观察FITC与GFAP共标。星形胶质细胞给予WTα-syn单体和聚集体,孵育1h撤掉培养基,用DMEM洗两遍后继续正常培养不同时间,western blotting和细胞免疫荧光检测胞内α-syn含量。星形胶质细胞给予α-syn单体或聚集体刺激1h,撤掉培养基,DMEM洗两遍后加入含蛋白酶体抑制剂MG132或自噬抑制剂3MA的培养基继续培养2h(单体)或24h(聚集体),western blotting和免疫荧光检测细胞α-syn含量。星形胶质细胞孵育溶酶体标记物Lyso Tracker和FITC-WTα-syn聚集体1h,观察Lyso Tracker与α-syn共定位。星形胶质细胞预孵育GB和BB 2h,给予α-syn聚集体刺激24h,检测胞内或上清α-syn水平。星形胶质细胞给予α-syn聚集体刺激1h,撤掉培养基,给予GB和BB以及MG132或3MA处理24h,western blotting检测α-syn、cathepsin B与LC3Ⅱ/Ⅰ水平。星形胶质细胞给予GB和BB处理不同时间,western blotting检测自噬相关指标。星形胶质细胞预孵育GB和BB 24h,撤掉培养基,给予α-syn聚集体刺激24h,收集细胞上清,western blotting检测上清中α-syn含量。SH-SY5Y给予星形胶质细胞条件培养基刺激24h,MTT实验观察细胞活力,并检测细胞LDH释放。结果:1)Western blotting显示星形胶质细胞基础状态下不表达α-syn,给予α-syn单体和聚集体刺激后胞内可检测到α-syn,而上清中α-syn含量逐渐降低;2)星形胶质细胞GFAP与FITC-WTα-syn聚集体共定位;3)Western blotting和免疫荧光显示,撤掉外源性α-syn单体和聚集体后,星形胶质细胞内α-syn含量逐渐降低;4)蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂3MA抑制星形胶质细胞内α-syn含量的降低;5)星形胶质细胞内的α-syn与溶酶体存在共定位;6)GB和BB进一步降低星形胶质细胞内α-syn含量;7)给予MG132和3MA后,GB和BB降低α-syn的作用被部分取消;GB和BB降低星形胶质细胞p62表达,增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例;8)GB和BB预处理的星形胶质细胞条件培养基抑制α-syn聚集体刺激的条件培养基所诱导的SH-SY5Y细胞活力下降和LDH释放。结论:1.星形胶质细胞摄取α-syn单体和聚集体,并通过蛋白酶体系统和自噬溶酶体途径清除α-syn。2.GB和BB增强星形胶质细胞自噬,促进α-syn清除。综上所述,本文的主要创新之处在于:1.揭示GB和BB减轻α-syn聚集体所致神经损伤研究发现GB和BB抑制α-syn诱导的细胞凋亡,减轻α-syn聚集体引起的神经损伤,为将GB和BB发展成为帕金森病等神经退行性疾病的神经保护剂积累学术基础。2.发现星形胶质细胞通过蛋白酶体和自噬溶酶体途径清除外源性α-syn研究发现星形胶质细胞摄取外源性α-syn单体和聚集体,并通过蛋白酶体系统和自噬溶酶体途径清除已摄取的α-syn。其中α-syn单体可迅速释放至胞外,并快速被清除,α-syn聚集体清除则较缓慢。该结果为深入研究帕金森病进程中星形胶质细胞的功能提供实验基础。3.阐明GB和BB促进星形胶质细胞对胞外α-syn聚集体的清除作用研究发现GB和BB增强星形胶质细胞自噬水平,促进星形胶质细胞对α-syn的清除作用,进而减轻α-syn刺激的星形胶质细胞条件培养基诱导的神经元损伤,为进一步研究GB和BB的神经保护作用机制提供理论依据。
【关键词】：α-突触核蛋白 星形胶质细胞 自噬 银杏内酯B 白果内酯 神经保护
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-19
• 前言19-25
• 第一部分 α-syn单体和聚集体制备及其神经毒性鉴定25-43
• 引言25-26
• 材料与方法26-33
• 结果33-40
• 讨论40-42
• 结论42-43
• 第二部分 银杏内酯B和白果内酯对星形胶质细胞清除 α-syn作用的影响43-59
• 引言43-44
• 材料与方法44-47
• 结果47-56
• 讨论56-58
• 结论58-59
• 结语59-62
• 参考文献62-71
• 附录 综述71-86
• 参考文献81-86
• 在读期间发表的研究论文86-87
• 致谢87

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