共抑制分子VISTA胞外段重组蛋白表达及其对EAE小鼠治疗作用的研究

发布时间：2017-08-31 19:24

  本文关键词：共抑制分子VISTA胞外段重组蛋白表达及其对EAE小鼠治疗作用的研究

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【摘要】：研究背景:共刺激分子参与调节T细胞的活化/凋亡,其中负性共刺激分子(共抑制分子)能够产生负性信号,削弱、限制或中止免疫应答,它可以诱导免疫耐受的形成并且维持外周耐受,从而阻止自体免疫发生。大量研究表明,共抑制分子在多发性硬化症/实验性脑脊髓炎(MS/EAE)的病程中发挥重要的作用,是治疗MS/EAE的潜在靶点。VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)是一个新发现的共抑制分子,也被称为PD-1H(Programmed death-1 homolog),属于Ig超家族的成员之一。VISTA广泛表达于造血细胞表面,在抗原呈递细胞(APCs)及T细胞表面也有表达,且VISTA无论表达在APCs上还是T细胞上,均表现出对T细胞应答的抑制作用。已有研究证实VISTAKO 2D2转基因小鼠的EAE发病程度、发病率均高于野生型2D2小鼠,表明VISTA会增加EAE自发的敏感性,与MS/EAE自身免疫疾病密切相关。为探讨VISTA对EAE小鼠病情的影响,本研究在不同的蛋白表达系统中表达VISTA胞外段重组蛋白并验证其活性;同时构建EAE小鼠模型,研究VISTA基因的表达与EAE小鼠病程进展的关系及VISTA胞外段重组蛋白对EAE小鼠病情的影响。研究方法:1、构建原核表达载体p ET22b-VISTA,表达并纯化VISTA胞外段重组蛋白,使用CCK8法验证其对脾脏细胞的增殖的影响以验证其活性;2、构建酵母表达质粒p PICZa A-VISTA,甲醇诱导VISTA胞外段重组蛋白的表达;构建哺乳动物表达载体p FUSE-VISTA-m Ig G2a,脂质体2000转染293T细胞,瞬时表达重组蛋白,RT-PCR及Western Blot检验重组蛋白表达;3、利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠,建立EAE模型,通过Real-time PCR检测VISTA在EAE小鼠不同病程时期脑组织及脾脏组织中的表达;4、建立预防性给药方案,VISTA胞外段重组蛋白给药治疗EAE小鼠,通过神经功能评分、病理学检测及Real-time PCR检测EAE小鼠发病高峰期脑组织及脾脏组织中IFN-γ的表达,研究VISTA胞外段重组蛋白对EAE小鼠的治疗作用。研究结果:1、成功构建原核表达载体p ET22b-VISTA并获得VISTA胞外段重组蛋白,纯化后的VISTA胞外段重组蛋白对Con A刺激的脾脏细胞具有显著抑制作用;2、构建重组质粒p PICZa A-VISTA,成功诱导表达VISTA胞外段重组蛋白;构建哺乳动物表达载体p FUSE-VISTA-m Ig G2a,经验证VISTA胞外段重组蛋白成功表达;3、成功建立EAE小鼠模型,发病率为100%(经神经功能评分及病理学检测证明)。通过Real-time PCR检测不同病程时期VISTA基因在脾脏及脑组织中的表达,结果显示VISTA的表达随病程变化。4、在预防性给药方案下,VISTA胞外段重组蛋白治疗EAE小鼠能够显著减弱疾病的发病程度:EAE组小鼠发病率为100%,给药组的发病率为71%;给药组发病起始时间为14.40±0.60天,显著迟于EAE组(12.14±0.40天,**p0.01);给药组的平均神经功能评分远低于同时期EAE组小鼠;脑组织和脊髓组织的HE染色结果显示,给药组较EAE组脊髓炎性细胞浸润程度显著减弱(***P0.001),给药组小鼠脑组织炎性细胞浸润程度比EAE组轻,但无统计学差异。脊髓组织LFB染色表明给药组脱髓鞘现象明显减轻。且无论在脑组织或脾脏组织中,VISTA胞外段重组蛋白给药组IFN-γ基因表达都显著低于EAE模型组小鼠。结论:本研究通过基因工程手段成功获得p ET22b-VISTA重组载体,通过诱导、表达、纯化获得了具有生物活性的VISTA胞外段重组蛋白;使用MOG35-55免疫小鼠,成功构建了EAE小鼠模型,经Real-time PCR检测发现VISTA基因在脾脏及脑组织中的表达随着EAE小鼠病程变化,证明VISTA参与了EAE病程的发展;使用VISTA胞外段重组蛋白给药治疗EAE小鼠,能够延缓EAE小鼠的发病、降低EAE小鼠的发病程度并下调EAE小鼠脾脏和脑组织中IFN-γ的表达。本研究为探讨VISTA对MS/EAE的治疗作用提供理论依据及实验基础。
【关键词】：共抑制分子 VISTA 实验性自身免疫性脑脊髓炎 IFN-γ
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 英文缩写一览表13-15
• 1 引言15-21
• 1.1 共抑制分子的概述15-16
• 1.2 共抑制分子与自身免疫疾病16-17
• 1.3 共抑制分子VISTA17-18
• 1.4 EAE模型研究进展18-19
• 1.5 研究目的与意义19-20
• 1.6 技术路线20-21
• 2 VISTA胞外段重组蛋白原核表达载体构建及蛋白诱导表达21-34
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 主要试剂21-22
• 2.1.2 主要仪器22
• 2.1.3 常用试剂配制22-23
• 2.2 实验方法23-27
• 2.2.1 原核表达载体pET22b-VISTA的构建23-25
• 2.2.2 重组质粒转化到表达菌株及VISTA胞外段重组蛋白诱导表达25
• 2.2.3 VISTA胞外段重组蛋白的可溶性分析25
• 2.2.4 VISTA胞外段重组蛋白包涵体变性及纯化25-26
• 2.2.5 VISTA胞外段重组蛋白包涵体复性26
• 2.2.6 VISTA胞外段重组蛋白的Western Blot验证26
• 2.2.7 VISTA胞外段重组蛋白活性验证26-27
• 2.3 实验结果27-32
• 2.3.1 重组质粒pET22b-VISTA的构建及验证27-29
• 2.3.2 VISTA胞外段重组蛋白的诱导表达及可溶性分析29
• 2.3.3 VISTA胞外段重组蛋白包涵体纯化29-30
• 2.3.4 VISTA胞外段重组蛋白包涵体复性及Western Blot验证30-31
• 2.3.5 VISTA胞外段重组蛋白活性验证31-32
• 2.4 讨论32-34
• 3 VISTA胞外段重组蛋白真核表达载体的构建及蛋白表达34-49
• 3.1 实验材料34-36
• 3.1.1 主要试剂34-35
• 3.1.2 主要仪器35-36
• 3.1.3 常用试剂配制36
• 3.2 实验方法36-41
• 3.2.1 真核表达载体pFUSE-VISTA-mIgG2a的构建36-38
• 3.2.2 RT-PCR检测VISTA-IgG2a融合蛋白的mRNA水平38-39
• 3.2.3 VISTA-mIgG2a融合蛋白的表达及Western Blot鉴定39
• 3.2.4 酵母表达载体pPICZaA-VISTA的构建39
• 3.2.5 重组菌株GS115/pPICZaA-VISTA的构建39-40
• 3.2.6 重组菌株GS115/pPICZaA-VISTA的蛋白诱导表达40-41
• 3.3 实验结果41-47
• 3.3.1 重组质粒pFUSE-VISTA-mIgG2a的构建及验证41-43
• 3.3.2 重组质粒pFUSE-VISTA-mIgG2a蛋白表达验证43-44
• 3.3.3 酵母表达重组载体pPICZaA-VISTA的构建及验证44-46
• 3.3.4 重组菌株GS115/pPICZaA-VISTA的菌液PCR验证46
• 3.3.5 VISTA胞外段重组蛋白的诱导表达鉴定46-47
• 3.4 讨论47-49
• 4 EAE模型构建及VISTA基因在病程中的表达变化49-62
• 4.1 实验材料49-50
• 4.1.1 主要试剂耗材49
• 4.1.2 主要仪器49-50
• 4.1.3 常用试剂配制50
• 4.1.4 实验动物50
• 4.2 实验方法50-54
• 4.2.1 EAE小鼠模型构建50-51
• 4.2.2 EAE小鼠体重监测及神经功能评分51
• 4.2.3 病理组织学检测51-52
• 4.2.4 EAE小鼠脾脏及脑组织总RNA提取52
• 4.2.5 VISTA荧光定量PCR（Real-time PCR）引物的设计及验证52-53
• 4.2.6 EAE小鼠不同病程时期脾脏、脑组织VISTA mRNA的表达53
• 4.2.7 数据统计分析53-54
• 4.3 实验结果54-60
• 4.3.1 EAE小鼠的行为及神经功能评分54-55
• 4.3.2 病理组织学检测55-57
• 4.3.3 VISTA Real-time PCR引物设计及扩增效率验证57-58
• 4.3.4 EAE小鼠不同病程时期脾脏、脑组织VISTA的表达58-60
• 4.4 讨论60-62
• 5 VISTA胞外段重组蛋白对EAE小鼠治疗作用的研究62-72
• 5.1 实验材料62
• 5.2 实验方法62-64
• 5.2.1 EAE小鼠模型给药62-63
• 5.2.2 EAE小鼠的体重监测及神经功能评分63
• 5.2.3 EAE小鼠的病理组织学检测63
• 5.2.4 Real-time PCR检测脾脏、脑组织IFN-γ 的表达63-64
• 5.2.5 数据统计分析64
• 5.3 实验结果64-70
• 5.3.1 VISTA胞外段重组蛋白对EAE小鼠病情的影响64-66
• 5.3.2 病理组织学检测66-69
• 5.3.3 脾脏及脑组织中IFN-γ 的表达69-70
• 5.4 讨论70-72
• 6 全文总结72-73
• 参考文献73-79
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果79-80
• 致谢80

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