基于PLGA膜与Necl-1蛋白构建体外组织工程化神经的研究

发布时间：2017-09-02 14:04

  本文关键词：基于PLGA膜与Necl-1蛋白构建体外组织工程化神经的研究

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【摘要】：第一部分背景：目前周围神经缺损的治疗效果尚不十分理想,研究组织工程神经修复周围神经缺损得到许多关注,常用的种子细胞是雪旺细胞(SCs),但是现存的问题是其与支架材料的粘附力不足,影响了组织工程化神经的构建及其效果。如增加细胞与载体之间的粘附力,提高载体上的细胞数量,有望改善其效果。目的：研究Necl-1蛋白对体外培养的SCs的影响,观察SCs的生物学特性,主要考察其对SCs增殖、粘附和形态维持作用及GDNF、BDNF和CNTF等神经营养因子的影响。方法：使用RSC96雪旺细胞进行体外培养,扩增培养备用, MTT法测定不同浓度的Necl-1对SCs的影响,筛选出三个较佳浓度(25μ/ml, 50μg/ml,100μg/ml)。用筛出来的三个较佳浓度的Necl-1进一步干预SCs,不加Necl-1为对照,分别于2d、4d和6d,通过检测细胞增殖、细胞活力FDA/PI荧光染色,苏木精-伊红染色,S-100b免疫组化测定及细胞RNA提取和实时荧光定量反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)检测GDNF、BDNF、CNTF、S-100b基因表达量,进一步考察Necl-1对SCs的促进作用。结果：MTT细胞毒性试验结果显示当Necl-1浓度为50μg/ml时,其对SCs的增殖促进作用最明显,浓度为250μ/ml后开始出现抑制作用。细胞增殖实验中,发现Necl-1各组在2d、4d、6d时所测MTT值均较对照组要高。细胞的FDA/PI荧光染色中Necl-1各组与空白对照组死活细胞比例差别不大。HE染色的结果显示各组细胞形态上并没有差异,但Necl-1各组在细胞密度方面较空白对照组大,且在浓度50μg/ml时达到最大。当Necl-1在浓度为50gg/ml时,分别在第4d、6d天的OD值相对较高。通过对SCs的S-100b免疫组化进行染色,发现Necl-1各组的SCs中S-100b阳性表达较对空白对照组相比有明显增加,且50μg/ml浓度的Necl-1培养SCs,其S-100b表达量最大。在基因表达方面,发现Necl-1各组中GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表达量较对照组均有显著上调。SCs在Necl-1浓度为50μg/ml下培养4d、6d时其GDNF、GDNF、S-100b的表达能力最强。而BDNF在2d时各组表达差异不大,但在4d时浓度为25μg/ml表现较为明显的促进作用,6d则为50μg/ml有较强的促进作用。结论：实验结果表明,适当浓度的Necl-1能促进SCs增殖和粘附,并能维持其细胞形态,增强GDNF、BDNF和CNTF等神经营养因子的表达,为SCs参与外周神经修复提供一个更为适宜的微环境。提示Necl-1为制备更为稳定的组织工程神经提供可能。第一部分背景：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)是由乳酸和羟基乙酸两种单体随机聚合而成,是一种可降解的功能高分子有机化合物,具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能,因此是一种广泛应用的组织工程神经支架。基于PLGA膜材料并结合Necl-1蛋白构建组织工程化神经,考察Necl-1对SCs的增殖粘附作用以及特异的锚定作用,探索制备组织工程神经的新思路。目的：通过蛋白因子结合组织工程技术,为周围神经修复提供新模型,检测SCs的相关生物学特性,探究SCs经Necl-1蛋白干预后在PLGA膜材料上的增殖及粘附情况。方法：将PLGA膜材料表层均匀涂上Necl-1蛋白,使其Necl-1化。在PLGA膜上种植SCs,在不同组问分别加入较佳浓度的Necl-1蛋白(25μg/ml、 50μg/ml、100μg/ml)进行试验。分别于2d、4d和6d三个时间点测定MTT细胞增殖量,考察PLGA膜联合Necl-1蛋白对SCs的增殖粘附作用的影响;通过FDA/PI, HE染色观察不同浓度下SCs形态特性的变化；通过S-100b免疫组化试验检测SCs特异蛋白的表达水平。采用RT-PCR检测相关基因GDNF、BDNF、CNTF、S-100b的表达。运用电子显微镜(SEM)观察细胞在PLGA膜上生长情况及形态特征。结果：SCs能较好地粘附于PLGA膜材料上生长。MTT细胞增殖实验在2、4、6d三个时间点上Necl-1各组均较空白对照组结果要好,尤其以N2(50μg/ml)浓度为最佳。细胞增殖实验的结果显示各组的OD值均较同期的无PLGA膜要高,其中N1、N2在4d、6d时间点上对细胞的增殖作用表现较好。通过HE染色观察可知其细胞形态并没有改变,Necl-1各组细胞在4、6d时成簇生长明显。FDA/PI荧光染色检测细胞活性,结果表明死活细胞比例方面空白组与药物组差别不大。免疫组化方面,N2(50μg/ml)浓度下SCs的S-100b表达量相对较高。对于Necl-1组基因表达的情况,实验得出无论GDNF、BDNF、CNTF、S-100b,其表达水平均大于空白对照组,随着培养时间的延长其表达水平均有显著上升,其中仍以N2(50μg/ml)浓度最强。扫描电子显微镜(SEM)的结果显示PLGA二维支架接种SCs 2d、4d和6d后,细胞能较稳定的粘附在支架表面铺展生长,部分细胞可向膜内嵌入生长。随着时间的延长,粘附在支架上的细胞数量明显增加。同时间点的N2(50μg/ml)组与空白对照组相比,N2组的细胞量明显高于空白对照组,且N2组细胞表面有大量突触形成。结论：结合Necl-1蛋白体外构建组织工程化神经更为稳定和优越,Necl-1蛋白有利于促进SCs在PLGA膜材料上增殖和粘附生长,对其表型及功能的维持有一定积极意义。基于PLGA和Necl-1蛋白体外构建组织化神经具有一定可行性,为进一步用于坐骨神经缺损动物模型提过依据和参照。
【关键词】：Necl-1 雪旺细胞 增殖 粘附 PLGA Necl-1 体外组织工程神经
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 个人简历3-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 第一部分 Necl-1蛋白对雪旺细胞生物学特性的影响15-38
• 前言15-16
• 1 材料和方法16-25
• 2 结果25-31
• 3 讨论31-34
• 4 结论34
• 5 参考文献34-38
• 第二部分 基于PLGA和Necl-1蛋白构建体外组织工程化神经38-58
• 前言38-39
• 1 材料和方法39-43
• 2 结果43-48
• 3 讨论48-51
• 4 结论51
• 5 参考文献51-58
• 附录58-59
• 综述 生物材料修复周围神经损伤的研究进展59-68
• 参考文献65-68
• 致谢68-69
• 攻读硕士研究生期间发表的学术论文69-70
• 附件70-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：778961