PINK1对α-Synuclein诱导的线粒体功能障碍的保护作用

发布时间：2017-09-03 14:23

  本文关键词：PINK1对α-Synuclein诱导的线粒体功能障碍的保护作用

  更多相关文章： 突触核蛋白 PINK1 帕金森疾病 膜电位 氧化压力 线粒体呼吸

【摘要】：帕金森疾病(Parkinson’s Disease,PD)是一种常见的渐进性神经退化疾病,主要以大脑黑质渐进性的丢失多巴胺能神经元为特征。其主要症状是运动功能的改变,如运动迟缓、静止性震颤、步态畸形和姿势不稳等病变。此外,非运动功能也受到了影响,如嗅觉丧失、便秘、抑郁、幻觉、睡眠障碍、认知功能下降。突触核蛋白(α-Synuclein,αS)的突变与显性家族性帕金森疾病相关,PINK1突变可以影响线粒体质量控制系统引发隐性家族性帕金森疾病。线粒体的功能障碍是帕金森疾病共同的发病病理机制,在散发性和家族性帕金森疾病中已经证实αS可以影响线粒体的损伤。αS是被研究证实与家族性帕金森疾病有关的第一个致病基因。有关帕金森疾病家族遗传史的研究都涉及到αS的基因改变,如基因突变和基因复制。目前αS蛋白总共有六个已知的氨基酸亚基突变与家族性帕金森疾病有关,即A30P,A53T,E46K,H50Q,G51D和A53E。尽管目前的研究发现某些突变可增加αS形成原纤维的倾向,并且这种低聚物的αS可能以多种方式发挥神经毒性作用,但是αS导致神经元死亡的确切机制还需要进一步的探索。此外,研究证实αS介导的神经元死亡可能是由多种机制而非单独机制引起的。如野生型αS可以调节多巴胺神经递质的传递,但是此功能的损失会导致帕金森疾病中多巴胺神经元的功能障碍或变性。此外,体外实验表明,过表达αS可影响线粒体结构和复合体I的活性,同时也伴随着活性氧的产生。在这些过表达αS的神经细胞模型中,研究发现αS可以从一个细胞传递到另一个细胞的现象。体内实验表明对纹状体进行局部注射αS纤维的小鼠大脑的许多区域均可观察到αS的病理性传播,并最终导致了黑质多巴胺能神经元的死亡。后续的研究表明αS细胞与细胞之间的传播机制类似于朊病毒的传播。PINK1是神经保护性激酶,具有维持线粒体复合体I活性和监测整个线粒体完整性的功能。线粒体质量控制系统可以调节正常线粒体中PINK1的蛋白降解,并且使PINK1选择性的聚集在受损线粒体的表面。膜内电位差作为能量源驱动PINK1进入到正常线粒体的内膜。在内膜上,PINK1被线粒体加工肽酶和早老素相关菱形蛋白酶裂解,裂解产物被运回细胞质随后被蛋白酶体所降解。去极化的线粒体膜电位降低而不能驱动PINK1进入线粒体内膜,因此导致pink1在线粒体外膜上大量聚集。依赖膜电位的pink1剪切和后续降解机制确保了唯有去极化的线粒体才能够聚集pink1。因此,pink1起到了选择性标记受损线粒体的作用。pink1/parkin诱导的线粒体自噬是清除损伤线粒体的质量控制途径。pink1作用在parkin的上游以触发线粒体自噬过程。pink1不仅参与了线粒体自噬的过程还可以调节线粒体复合体i活性和维持神经元活性。pink1在线粒体自噬以及与自噬无关的活动中均以激酶依赖性的方式发挥作用。pink1可以磷酸化线粒体hsp90家族分子伴侣trap1,线粒体膜间隙蛋白酶htra2/omi和线粒体复合体i亚基ndufa10。pink1可使线粒体复合体i亚基ndufa10丝氨酸磷酸化,用以调节线粒体复合体i的活性。ndufa10的过表达可以恢复复合体i活性并能拯救pink1基因缺陷型的苍蝇和成纤维细胞的表型。pink1对ndufa10活性的调节是独立于线粒体自噬进行的,因为沉默ndufa10并不会影响细胞的线粒体自噬。pink1聚集在去极化线粒体表面,可以将线粒体外膜上的泛素磷酸化。磷酸化的泛素可以促使parkin招募到线粒体外膜上,同时parkin也被pink1所磷酸化。pink165位丝氨酸发生磷酸化后强力激活了e3连接酶parkin的活性,引起一些线粒体外膜蛋白发生磷酸化,包括线粒体融合蛋白,tom20,tom4,tom70和omp25。定量蛋白质组学和活细胞成像的研究表明,pink1可使线粒体上的泛素磷酸化和蛋白泛素链多磷酸化。受损线粒体广泛的泛素化最终引发了线粒体的自噬反应,从而清除了损伤的线粒体。这个机制解释了依赖pink1的parkin从细胞质到线粒体表面的募集过程,线粒体的去极化和错误折叠蛋白积累也可以诱导parkin的募集。活性氧作为正常呼吸的副产物主要是由线粒体产生的。线粒体的功能发生障碍往往会引起活性氧的产量增加,增加的活性氧对细胞的生存具有一定的危害。细胞具有各种抗氧化酶和还原型谷胱甘肽,因此具有一定的抗氧化能力。细胞的抗氧化能力可以清除活性氧,使细胞可以在一定水平的活性氧自由基环境中存活。若活性氧的水平超过细胞的抗氧化能力,细胞就会出现氧化压力状态。氧化压力状态的长时间持续会损伤蛋白质,脂类和核酸进而导致细胞死亡。线粒体功能障碍造成了较高水平的氧化压力状态,由此引起了有害的生化改变,如增加的线粒体dna突变和减少的膜电位。组织炎症产生的活性氧会对氨基酸进行化学修饰,还可以通过改变蛋白质的功能、结构和抗原性,影响细胞存活并可能涉及到炎症相关的帕金森疾病。本课题目标是研究αS过表达对线粒体功能的影响以及PINK1在保护αS诱导的线粒体功能障碍中的重要性。对PINK1保护作用的研究是基于最近的研究成果确立的,它表明PINK1基因缺陷的小鼠更容易受到αS诱导的神经元毒性伤害。由于PINK1具有维持线粒体质量控制体系的作用,因此我们研究PINK1缺失是否会加剧αS诱导的线粒体缺陷。为研究线粒体的功能变化,对过表达和不表达A53T-αS的野生型和PINK1敲除型小鼠胚胎成纤维细胞测定线粒体膜电位,活性氧和线粒体呼吸。尽管小鼠胚胎成纤维细胞在生理表现上不同于神经元细胞,但是许多帕金森疾病的相关研究都采用了小鼠胚胎成纤维细胞。因为小鼠胚胎成纤维细胞可以很容易地生长并可以通过永生化产生永久的细胞系。此外,线粒体在所有的细胞中都执行着相同的功能,因此研究小鼠胚胎成纤维细胞的线粒体,对所有类型的细胞都具有代表性。不同的是,线粒体功能障碍对不同类型细胞的生存影响不同,神经元对线粒体的功能障碍是特别敏感的。本课题构建了编码A53T-αS的慢病毒载体质粒,此质粒与编码水疱性口炎病毒G蛋白VSV-G,HIV-gag/pol和Rev质粒共同转染293T细胞以产生重组的逆转录病毒。用A53T-αS逆转录病毒感染预先经过SV40 large T永生化的野生型和PINK1敲除型小鼠胚胎成纤维细胞,通过流式细胞仪检测技术和免疫化学检测法来检测感染后的小鼠胚胎成纤维细胞是否可以稳定过表达A53T-αS。获得稳定表达的细胞系后,用获得的细胞系来研究野生型和PINK1敲除型的小鼠胚胎成纤维细胞中线粒体功能以及活性氧的变化。此外,构建编码氧化还原敏感性蛋白Ro-GFP,利用Ro-GFP在细胞内的定位对不同的细胞器进行活性氧测量。本课题结果表明,表达A53T-αS的PINK1敲出型小鼠胚胎成纤维细胞与野生型细胞相比具有显著的线粒体功能障碍,如线粒体膜电位发生改变,细胞质内的活性氧含量增加,细胞剩余呼吸能力减弱。总之,这些结果表明PINK1缺失可能是通过加剧αS-A53T诱导的线粒体损伤和增加细胞质内活性氧从而引起神经元N失的增加。
【关键词】：突触核蛋白 PINK1 帕金森疾病 膜电位 氧化压力 线粒体呼吸
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• CHAPTER 1 Introduction11-24
• 1.1 Parkinson’s disease11-13
• 1.2 α-Synuclein13-17
• 1.2.1 Lewy bodies13
• 1.2.2 α-Synuclein gene mutations linked with inherited PD13-14
• 1.2.3 α-Synuclein structure14-15
• 1.2.4 α-Synuclein and cytotoxicity15-17
• 1.3 PINK 1 and Parkin17-21
• 1.3.1 PINK 117-18
• 1.3.2 PINK1 and Parkin mediate mitophagy of damaged mitochondria18-20
• 1.3.3 Mitophagy-independent functions of PINK120-21
• 1.4 Reactive oxygen species (ROS)21
• 1.5 Complex I21-22
• 1.6 Purpose and main content22-24
• 1.6.1 Overall aim22
• 1.6.2 Main research contents22-24
• CHAPTER 2 Materials and Methods24-41
• 2.1 Reagents and Equipment24-25
• 2.1.1 Reagents24-25
• 2.1.2 Equipment25
• 2.2 Methods25-41
• 2.2.1 Molecular cloning25-31
• 2.2.2 Calcium phosphate transfection31-32
• 2.2.3 Western Blotting32-35
• 2.2.4 Immunocytochemistry35-36
• 2.2.5 Virus Packaging36
• 2.2.6 Infection36-37
• 2.2.7 Flow cytometry37-38
• 2.2.8 Mitochondrial respiration (Extracellular Flux Analyzer)38
• 2.2.9 Protein extraction38-40
• 2.2.10 Transmission Electron Microscopy40-41
• CHAPTER 3 Results and Discussion41-59
• 3.1 Construction of retroviral vectors encoding A53T-αS41
• 3.2 Cell culture and transfection41-42
• 3.3 Confirmation of α-Synuclein expression by Western blot42-43
• 3.4 Packaging of PTY-CMV-A53T-Syn virus43-44
• 3.5 Infection of MEFs with PTY-CMV-A53T-Syn virus44-45
• 3.6 Detection of A53T-αS expression in virus-transduced WT andPINK1-deficient MEFs with immunocytochemistry45-46
• 3.7 Quantification of A53T-αS expression by flow cytometry46-48
• 3.8 Measurement of mitochondrial membrane potential (Δψm) with flowcytometry48-49
• 3.9 Measurement of Δψm and mitochondrial mass in the same cells withconfocal microscopy49-50
• 3.10 Oxidative stress in cytoplasm and mitochondrial matrix of WT andPINK1-deficient MEFs expressing A53T-αS50-54
• 3.10.1 Generation of recombinant retroviruses for expression of cytosolicand mitochondria-targeted ro GFP50-52
• 3.10.2 Transduction of WT and PINK1-deficient MEFs with Cyto-ro GFPand Matrix-ro GFP retroviruses52-53
• 3.10.3 Measurement of cytoplasmic and mitochondrial oxidative stress(ROS) in Ro-GFP retrovirus-transduced MEFs53-54
• 3.11 Measurement of mitochondrial respiration with extracellular fluxanalysis54-56
• 3.12 Electron microscopy analysis of mitochondrial morphology56-57
• 3.13 Quantification of detergent-soluble and insoluble αS57-59
• Conclusions59-60
• Discussion60-63
• References63-71
• Acknowledgement71

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