电刺激小脑顶核诱导脑缺血大鼠未知miRNA的鉴定及功能分析

发布时间：2017-09-13 16:14

  本文关键词：电刺激小脑顶核诱导脑缺血大鼠未知miRNA的鉴定及功能分析

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【摘要】：早期的研究发现电刺激小脑顶核(fastigial nucleus stimulation, FNS)能够启动内源性神经保护作用,减轻局灶性脑缺血损伤,但其机制及具体途径仍未阐明。新发现的微小RNA (microRNA, miRNA)作为一类重要的内源性分子,其参与调控基因表达的重要意义为FNS的神经保护机制研究提供了新的思路。前期我们采用高通量测序及芯片技术对电刺激小脑顶核1h后脑缺血大鼠的脑组织进行miRNA的表达谱分析,提示差异表达的miRNA可能通过靶向调控相关基因在预电刺激小脑顶核的大鼠中发挥脑保护作用。本研究主要对这些未知的miRNA序列进行鉴定和分析,并初步探索其在脑缺血神经保护中的功能及其作用机制。第一部分电刺激小脑顶核诱导脑缺血大鼠未知miRNA的鉴定[目的]分析深度测序获得的电刺激小脑顶核诱导脑缺血大鼠的未知miRNA序列,以筛选结构典型、具有高度保守性的真正的miRNA。[方法]利用生物信息学方法,对前期深度测序获得的原始序列数据进行分类注释,根据miRNA的典型结构特性及物种保守性筛选候选的新的miRNA;利用实时定量PCR的方法对新的miRNA进行表达验证。[结果]经比对,共鉴定出781个与哺乳类物种同源的未知的miRNA成熟序列。通过进一步的生物学特征分析,我们鉴定出一个新的miRNA(PC-3p-3469_406),结合miRNA的保守性特征,我们将其暂命名为rno-miR-676-1。 RT-PCR证实这个新的miR-676-1在肌肉和脑组织的表达量最高。[结论]mo-miR-676-1 (PC-3p-3469_406)是结构典型、进化上具有保守性的新的miRNA。第二部分mo-miR-676-1在预电刺激小脑顶核后缺血再灌注损伤中的作用[目的]探讨rno-miR-676-1在预电刺激小脑顶核后大鼠脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用机制。[方法](1)将SD雄性大鼠随机分3组：①假手术组；②单纯脑缺血组；③预电刺激组；RT-PCR检测rno-miR-676-1在电刺激小脑顶核后局灶性脑缺血大鼠的差异表达情况。(2)通过侧脑室注射rno-miR-676-1的类似物或抑制物进行体内的过表达和抑制表达实验,动物行为学评估神经功能缺损情况、TTC染色测定梗死体积、TUNEL染色检测细胞凋亡指数,探讨rno-miR-676-1在缺血损伤中的生物学功能。(3)生物信息软件预测rno-miR-676-1的靶基因,双荧光素酶报告系统基因检测系统验证rno-miR-676-1与靶基因的相互作用关系。[结果](1)与单纯脑缺血再灌注损伤的大鼠相比,电刺激小脑顶核后脑缺血大鼠的rno-miR-676-1表达上调。(2) rno-miR-676-1上调后,脑缺血大鼠的神经功能缺损症状减轻、梗死体积减小、神经元凋亡指数降低；而rno-miR-676-1表达下调后脑缺血大鼠的神经功能缺损症状加重、梗死体积增大、神经元凋亡指数升高。(3)软件预测AUP1、CCNJ、PDPK1、BCL2L2和HRAS是rno-miR-676-1的靶基因,但双荧光素酶报告系统显示其3’UTR与rno-miR-676-1无明显相互作用。[结论]电刺激小脑顶核后脑缺血大鼠的rno-miR-676-1表达上调。rno-miR-676-1上调在脑缺血再灌注过程中有保护性作用,表达下调则会加重脑缺血损伤。
【关键词】：电刺激小脑顶核 新的microRNA 深度测序 缺血/再灌注
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 个人简历3-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-16
• 第一部分 电刺激小脑顶核诱导脑缺血大鼠未知miRNA的鉴定16-31
• 1.1 材料与方法16-22
• 1.1.1 实验动物16
• 1.1.2 使用的数据库及分析软件16
• 1.1.3 主要的仪器和设备16-17
• 1.1.4 主要的试剂和试剂盒17-18
• 1.1.5 电刺激小脑顶核18
• 1.1.6 大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓模型的制备18
• 1.1.7 深度测序18-19
• 1.1.8 小RNA的注释分类19
• 1.1.9 预测新的miRNA19-20
• 1.1.10 Trizol法提取总RNA20
• 1.1.11 总RNA的质量检测20-21
• 1.1.12 RT-PCR检测miRNA的表达水平21-22
• 1.1.13 统计学分析22
• 1.2 结果22-28
• 1.2.1 深度测序结果及其分析22-26
• 1.2.2 候选新的miRNA(PC-3p-3469_406)的生物学特征26-28
• 1.3. 讨论28-31
• 第二部分 rno-miR-676-1在预电刺激小脑顶核后缺血再灌注损伤中的作用31-50
• 2.1 材料与方法31-38
• 2.1.1 实验动物31
• 2.1.2 使用的数据库及分析软件31
• 2.1.3 主要的仪器和设备31-32
• 2.1.4 主要的试剂和试剂盒32-33
• 2.1.5 电刺激小脑顶核33
• 2.1.6 大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓模型的制备33
• 2.1.7 神经功能评分33-34
• 2.1.8 脑梗死体积比例测定34
• 2.1.9 侧脑室注射34-35
• 2.1.10 RT-qPCR检测miRNA的表达35
• 2.1.11 miRNA靶基因生物信息学预测35
• 2.1.12 miRNA/靶mRNA相互作用的结构学验证35-36
• 2.1.13 TUNEL染色36-37
• 2.1.14 统计学分析37-38
• 2.2. 结果38-47
• 2.2.1 miR-676-1在电刺激小脑顶核后缺血/再灌注大鼠的表达差异38
• 2.2.2 miR-676-1的生物学功能鉴定38-42
• 2.2.3 miR-676-1的靶基因鉴定42-47
• 2.3. 讨论47-50
• 结论50-51
• 参考文献51-55
• 附录1 候选新的miRNA前体及其回环结构55-60
• 附录2 构建的表达载体的测序结果60-63
• 附录3 英文缩略词63-65
• 综述 电刺激小脑顶核的神经保护作用机制及其在脑缺血损伤中的临床应65-78
• 参考文献73-78
• 致谢78-79
• 攻读学位期间发表的学术论文79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 郭钢花;李哲;乐林;关晨霞;;小脑顶核电刺激对脑卒中后抑郁及日常生活能力的影响[J];神经损伤与功能重建;2008年04期

2 隆昱洲;雷进;罗丽华;尚正良;刘姚;;小脑顶核电刺激对脑梗死患者认知功能的影响[J];实用医学杂志;2013年03期

3 黄艳君;罗勇;;电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内神经干细胞增殖的影响[J];中国康复医学杂志;2008年03期

4 黄艳君;罗勇;;电刺激小脑顶核对成年大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内Nestin表达的影响[J];中国康复理论与实践;2007年08期

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本文编号：844707